不同猪瘟疫苗母源抗体持续期及半衰期研究

王遵宝，李俊辉，贺 笋，杨金鹿，豆智华，王 涛，刘迦慧

（天康生物股份有限公司，乌鲁木齐 830032）

猪瘟（classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种高度接触性传染病，严重危害养猪业的发展，是世界动物卫生组织（Office International des Epizooties，OIE）规定的必报告疫病，该病以发病急、持续高热，全身出血和白细胞减少为特征，发病率和死亡率高[1-2]。猪胎盘属于上皮绒毛膜型，母源抗体不能通过胎盘屏障，所以仔猪需通过吮吸初乳获得母源抗体，从而获得猪瘟被动免疫保护力[3-5]。

免疫预防是当前我国防控猪瘟的主要措施之一。临床应用中，猪瘟活疫苗的免疫效果受自身抗体干扰影响较大。尤其是仔猪免疫受母源抗体影响大，不合理的免疫程序可能导致免疫失败。仔猪的母源抗体滴度会随着日龄的增长而衰减，母源抗体的半衰期一般为14 d左右，但由于母猪品种、饲养管理水平、疫苗种类及免疫程序的不同，导致母源抗体效价和持续时间均不一致。母源抗体的存在为哺乳仔猪提供了一定时间内抵御病毒的被动保护，但其又会影响免疫接种。母源抗体过高，接种猪瘟活疫苗会被母源抗体中和；母源抗体过低，仔猪在免疫空白期易受环境中猪瘟病毒的侵袭[6-8]。根据母源抗体衰减规律，确定仔猪最佳首免日龄，从而制定合适的猪瘟免疫程序至关重要，可保证猪瘟免疫效果，有效减轻仔猪早期免疫负担。

猪瘟E2亚单位疫苗是应用现代分子生物学技术将猪瘟病毒E2基因重组于杆状病毒内，在昆虫细胞上培养表达猪瘟病毒E2蛋白而制成的新型基因工程疫苗。该疫苗只诱导猪体产生E2蛋白抗体，可以通过对E2、Erns或NS3蛋白的抗体检测区分免疫和野毒感染猪[9-10]。此外，该疫苗中重组E2蛋白含量高，可诱导机体产生高水平猪瘟抗体，受自身猪瘟抗体干扰小。

为了比较两种不同疫苗在临床上的免疫效果及受自身抗体干扰的程度，本研究以抗体水平相近的妊娠母猪及其所产仔猪作为研究对象，通过监测母猪及其所产仔猪血清猪瘟抗体，比较不同猪瘟疫苗免疫母猪后产生的抗体差异，同时分析其母源抗体衰减规律，推导、计算断奶仔猪母源抗体半衰期，为临床应用中预测母源抗体持续期，合理制定仔猪免疫程序提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物在天康畜牧公司繁育猪场，用2～3胎次的二元母猪60头及其所产仔猪，每窝随机选择3头，共计180头仔猪，打双耳标用于试验。

1.2 疫苗猪瘟病毒E2亚单位疫苗、猪瘟兔化弱毒苗（传代细胞源）。

1.3 检测试剂PK-15细胞、猪瘟兔化弱毒细胞适应株由天康生物股份有限公司保管和供应；猪瘟阳性血清购自中国兽医药品监察所；兔抗猪FITC标记IgG二抗购自Sigma公司；猪瘟病毒抗体检测试剂盒购自爱德士公司（99-43220）；DMEM、胎牛血清等购自Gibco公司；甲醛、磷酸盐等为国产分析纯。

1.4 动物免疫分组及采血在天康畜牧公司繁育猪场，用2～3胎次的妊娠期二元母猪60头，按照表1进行分组、免疫，每组20头，对照组不免疫。免疫前、分娩后采血，分离血清，用于测定猪瘟抗体。该猪场前期用猪瘟兔化弱毒苗（hog cholera lapinized vaccine，HCLV）进行猪瘟免疫、防控工作。母猪饲养条件、其他疫苗免疫程序均保持一致。试验母猪分娩后每窝随机选择3头仔猪，打双耳标编号，在出生后每两周采血，无菌分离血清，测定猪瘟抗体。为保证母源抗体对群体的保护效力，避免疾病发生，当试验组的猪瘟抗体平均阻断率低于50%或阳性率低于60%时，停止该组猪瘟抗体监测，免疫猪瘟疫苗。

表1 试验母猪免疫分组表Table 1 The immune grouping of test sows

1.5 抗体检测方法

1.5.1 猪瘟病毒ELISA抗体检测方法 参见美国爱德士《猪瘟病毒抗体检测试剂盒》说明书（编号：99-43220-01）。

1.5.2 猪瘟病毒血清中和抗体测定方法 将待测血清样本置于56℃水浴中灭活30 min，在96孔板中用DMEM将待测血清样本2倍梯度稀释至第11排，12排作为阴性对照，加入猪瘟兔化弱毒，100～300TCID50/孔，置37℃、5% CO2培养箱中进行血清中和。另取96孔板进行病毒含量的反滴定。感作1 h后，每孔加入100 μL的PK-15细胞，置37℃、5% CO2培养箱中继续培养，3 d后用免疫荧光法在倒置荧光显微镜下判读荧光信号，以Reed-Muench方式计算血清的中和抗体滴度。反滴定后病毒含量在50～300TCID50/50μL则所稀释病毒符合检验要求，判定的血清中和抗体成立。

1.6 数据统计方法采用SPSS 13.0软件统计分析数据，使用重复测量方差分析中LSD分析比较免疫前后、不同组间抗体差异；用双变量相关分析母猪分娩后血清中和抗体滴度与仔猪1日龄血清中和抗体滴度间相关性；根据母源中和抗体结果，采用线性回归分析，按以下公式计算不同免疫组断奶仔猪母源抗体半衰期（T1/2）。

T1/2=LN 2/λ，其中λ为回归方程斜率的绝对值。

2 结果与讨论

疫苗免疫是我国猪瘟防控的主要措施。由于受母源抗体干扰较大，仔猪免疫程序不合理常导致猪瘟免疫防控失败。不同猪瘟疫苗免疫母猪后，产仔猪的母源抗体持续期监测对仔猪首免日龄确定及免疫程序的制定至关重要。

母猪血清抗体ELISA检测结果显示，免疫前各组猪瘟抗体水平差异不显著，阳性率为100%。试验猪分娩后抗体均为阳性，E2组猪瘟抗体提升明显，阻断率平均值最高为91.62%，经LSD分析，E2组阻断率与HCLV组和对照组相比差异显著（P＜0.05），离散度远小于免疫前及其他试验组，提示经过免疫有效提升了猪群抗体水平和整齐度；HCLV组抗体有所提升，阻断率均值为81.09%，离散度变化不大；对照组抗体阻断率均值最低，较免疫前有所下降，离散度变大，详见表2。

表2 试验猪免疫前后猪瘟ELISA抗体检测结果Table 2 CSFV ELISA antibody in sows before and after vaccination

母猪血清中和抗体检测结果表明，免疫组分娩后中和抗体滴度显著高于免疫前和同期对照组，其中E2组抗体滴度均值最高，为11.4log2，HCLV组抗体滴度均值为9.5log2，对照组分娩后抗体较免疫组低，该结果与ELISA检测结果一致（表3）。尽管所选试验猪免疫前抗体水平相近，但由于兔化弱毒疫苗受猪瘟基础抗体影响较大，所以不能客观地评价、比较两种疫苗真实的免疫效果，侧面体现出E2亚单位疫苗受抗体干扰较小的特点。

仔猪母源抗体ELISA检测结果显示，各试验组仔猪l日龄时抗体阻断率最高，之后缓慢下降，21 d断乳时抗体水平明显下降。经LSD分析，E2组仔猪母源抗体与HCLV组和对照组相比差异极显著（P＜0.05）。按照猪瘟抗体阻断率均值不低于50%且阳性率不低于60%的判定标准，E2亚单位疫苗组仔猪的母源抗体持续期为70 d，HCLV组仔猪母源抗体持续期为28 d，未免疫对照组为14 d，详见表4。

表3 试验猪免疫前后血清猪瘟中和抗体滴度（log2，平均值±标准差）Table 3 The neutralization antibody against CSFV in sows before and after vaccination （log2，Mean±SD）

仔猪血清中和抗体测定结果与ELISA检测结果一致，即仔猪1日龄时抗体水平最高，E2亚单位疫苗组可达10.3log2。随日龄增大，猪瘟抗体呈逐渐下降趋势，断奶前下降缓慢，断奶后（21日龄）抗体水平开始明显下降，与文献报道的结果一致[11-12]。其中E2亚单位疫苗组仔猪10周龄时中和抗体滴度为5.3±2.1log2，12周龄时已下降至3.8±1.5log2；HCLV组在4周龄时中和抗体滴度为5.8±1.9log2，6周龄时中和抗体滴度下降至3.9±2.3log2；对照组在4周龄时中和抗体滴度已下降至4log2以下。有研究报道猪瘟中和抗体滴度为1∶8～1∶16是猪瘟抗体保护的临界线[13-14]，所以本研究以中和抗体滴度几何均值不低于1∶16为母源抗体持续期的判定标准，E2亚单位疫苗组仔猪母源抗体持续期最长，仔猪母源抗体可持续至70 d，HCLV组为28 d，对照组母源抗体持续期最短，为14 d（图1）。

表4 仔猪母源抗体ELISA检测结果Table 4 Maternal antibody by blocking ELISA in piglets

图1 仔猪血清猪瘟中和抗体滴度（log2）测定结果Fig.1 The result of neutralization antibody titer in different ages of piglets (log2)

国内文献报道的仔猪母源抗体半衰期差异较大，不仅受母猪品种、疫苗类型、免疫程序、饲养管理水平等影响较大，而且与其统计分析方法有关，并未见半衰期计算方法[15-16]。本研究为了比较同等条件下两种疫苗的母源抗体半衰期，用SPSS 13.0软件，以断奶后仔猪（21日龄断奶）抗体监测日龄为自变量，中和抗体滴度的自然对数值为因变量，用线性回归分析，拟合了断奶仔猪母源抗体的衰减曲线，由此得到线性回归方程，根据公式计算不同免疫组的仔猪母源抗体半衰期。分析结果表明，同等条件下E2组仔猪母源抗体半衰期最长，为10.5 d，HCLV组为7.5 d。

相关性分析结果表明，母猪分娩后血清中和抗体滴度与1日龄仔猪血清中和抗体滴度间呈显著正相关（R2=0.96），与国内外学者研究结果一致，即仔猪母源抗体受母猪抗体影响大，两者成显著正相关，母猪猪瘟抗体高则其所产仔猪母源抗体滴度高[17-18]。

猪瘟E2亚单位疫苗是利用昆虫细胞-杆状病毒表达的E2重组蛋白与进口油佐剂乳化而制成的新型基因工程疫苗，可通过Erns、E2抗体的测定区分疫苗免疫与野毒感染猪，有助于猪场猪瘟净化。为了更好地使用E2亚单位疫苗防控猪瘟，确定仔猪首免日龄，对于合理制定适合本疫苗的免疫程序具有重要的意义，本研究对比了猪瘟E2亚单位疫苗和猪瘟兔化弱毒苗免疫妊娠母猪后本体及其所产仔猪体内猪瘟抗体的衰减规律。结果表明，妊娠母猪免疫E2疫苗后，无任何注苗引起的不良反应；免疫后抗体水平显著提高，受自身抗体干扰影响小，所产仔猪的中和抗体滴度高、半衰期短、持续性长，可持续至70日龄，显著优于其他试验组。免疫HCLV疫苗后，抗体水平有所提升，但所产仔猪母源抗体持续期短，为28 d。

本研究掌握了猪瘟E2亚单位疫苗母源抗体衰减规律，明确了仔猪首免日龄为70日龄，不仅为该疫苗在临床上免疫程序的合理制定提供了依据，而且有效地减轻了仔猪早期免疫负担、提高了疫苗免疫功效，为实现育肥猪免疫一针猪瘟疫苗出栏上市奠定了试验基础。