表达猪瘟病毒E2蛋白的重组PRRSV疫苗株rPRRSV-E2的水平传播能力研究

高 飞，姜一峰，李国新，张玉娇，虞凌雪，周艳君，李丽薇，郑海红，童光志

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学，扬州 225009）

猪瘟（classical swine fever，CSF）和猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是临床上危害我国养猪业的重要传染病，造成的经济损失巨大[1-4]，尤其是2006年暴发的高致病性猪繁殖与呼吸综合征（highlypathogenic PRRS，HPRRS）。这两种疫病都是“国家中长期动物疫病防控规划（2012-2020年）”中优先防治的一类动物疫病。致病病原体分别为猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic porcine respiratory syndrome virus，HP-PRRSV）。为了有效预防和控制这两种疫病在我国的流行和蔓延，我们基于HP-PRRSV的弱毒疫苗株的反向遗传操作平台[5]，利用PRRSV基因组转录调控序列（transcriptional regulatory sequence，TRS）调控亚基因组非连续性转录的特性[6-7]开展了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗（rPRRSV-E2）的研究。前期研究表明，rPRRSV-E2基因工程疫苗免疫猪体1次后能够为HPPRRS和CSF提供100%的免疫保护，是一种非常有前途的基因工程疫苗候选株[8]。本研究对rPRRSV-E2在猪体的留存和排毒能力，及其在猪群中的水平传播能力进行了研究。

1 材料与方法

1.1 疫苗与细胞表达猪瘟E2蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗候选株（rPRRSV-E2）第5代细胞毒，病毒滴度106.5TCID50/mL。MARC-145细胞由本实验室保存。

1.2 动物试验设计15头35日龄PRRS抗原/抗体阴性的健康仔猪，按105.0TCID50/头的剂量肌肉注射接种rPRRSV-E2第5代细胞毒，每隔7 d随机采集血清、鼻拭子和粪便样品各10份，用PRRSV real-time PCR[9]检测病毒，持续3个月。同时，将5头PRRS抗原/抗体阴性的相同日龄健康仔猪与10头免疫猪只混养，每隔7 d采集血清样品进行PRRS抗原和抗体检测。所有猪只在试验期间每天观察临床表现，并定期测体温，记录数值。

1.3 样品采集对试验猪只逐头采集血液样品与拭子样品。用注射器于前腔静脉采集血液5 mL，3000×g离心10 min，将分离的血清分装做好标记用于后期的检测。用棉签刮取猪鼻腔深处、肛门部位样品，取样后将棉签置于2 mLPBS中，振荡混匀，3000×g离心10 min取上清液分装做好标记用于后期的检测。

1.4 抗原和抗体检测使用IDEXX 公司生产的PRRS和CSF的抗体检测试剂盒对血清中PRRSV和CSFV的抗体进行检测。用PRRSV荧光定量PCR方法对血清和拭子中的病毒载量进行检测；用实验室建立的PRRSV ORF5和E2基因检测方法对未分离到病毒的细胞上清液进行PCR检测，检测用引物见表1。

1.5 病毒分离取生长良好的MARC-145细胞的96孔细胞培养板，弃去细胞培养液，加入采集的血清样品，50 μL/孔，每个样品重组2孔。37℃吸附1 h，弃去血清样品，PBS洗涤1次，加入细胞培养液，200 μL/孔。置于37℃、5% CO2的培养箱中培养4～5 d，每日观察细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）并做好记录。

1.6 病理学观察待试验结束，扑杀所有试验猪只并剖检，观察和记录各组织脏器的大体病变，并采集病死猪的肺脏、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、扁桃体、淋巴结、脑、胃和小肠组织，用10%中性福尔马林固定后按常规加工方法制作病理切片，观察组织病理学变化[8,10]。

2 结果

2.1 临床症状3组试验仔猪在试验观察期内生长正常，无发烧、厌食、精神沉郁、跛行等临床症状。rPRRSV-E2免疫组、同居感染观察组和阴性对照组（Mock组）之前临床症状表现无显著差异。各试验组体温变化见图1。

2.2 血清中病毒含量变化情况免疫组猪只在免疫后第7 d血清中病毒含量呈阳性，持续至免疫后第28 d，从免疫后第28 d直至试验结束均未在血清中检测到病毒，结果见图2。对28 d后拷贝数超过阴性对照的血清样品进行病毒分离，均未能分离到病毒。所有血清样品中病毒抗原检测为阴性。

2.3 血清抗体水平变化情况分析免疫猪只PRRSV和CSFV的抗体自免疫后14 d全部转为阳性，PRRSV在免疫后28 d到达峰值（图3A），CSFV在免疫后第35 d到达峰值（图3B），之后持续维持在一个较高的水平至试验结束；同居感染观察组猪只（B组）和阴性对照组（Mock组）在试验期间血清中两种抗体均为阴性（图3B）。对免疫组血清样品的CSFV中和效价进行了测定，免疫组猪只血清样品中CSFV中和抗体水平在rPRRSV-E2免疫后持续上升，在免疫后35 d中和效价能够达到1∶1024。直至实验结束，中和抗体的效价一直能维持在1∶1000的水平。B组和C组均为阴性（图3C）。

表1 荧光定量RT-PCR使用引物序列Table 1 Oligonucleotides used for RT-qPCR

图1 rPRRSV-E2免疫后各组猪只体温变化情况Fig.1 Body temperature curve of pigs in each group after rPRRSV-E2 immunization

图2 rPRRSV-E2免疫后猪只血清中病毒含量检测结果Fig.2 Detection results of virus load in swine serum samples after rPRRSV-E2 immunization

图3 rPRRSV-E2免疫后血清抗体水平变化情况分析Fig.3 Antibody changes in serum samples after rPRRSV-E2 immunization in test groups

2.4 鼻拭子和肛拭子中病毒含量变化情况对所有试验组的猪只鼻拭子和肛拭子样品利用本试验室建立的方法进行荧光定量PCR检测。rPRRSV-E2免疫组及其同居感染观察组中拭子样品和空白对照组相比，病毒拷贝数均较低，无显著差异（图4）。对其中病毒拷贝数略高于阴性对照的样品进行病毒分离，在MARc-145细胞上进行传代，观察细胞病变及IFA荧光结果，结果显示，免疫组猪只从免疫开始至试验结束，均未从拭子中分离到PRRSV。

图4 rPRRSV-E2免疫后猪只鼻拭子和肛拭子中病毒含量检测结果Fig.4 Detection results of viral load in swine nasal and anus swab samples after rPRRSV-E2 immunization

2.5 病理学检查结果将试验猪只于免疫后3个月剖杀检查，免疫组与同居感染组及阴性对照组试验猪的肺脏、脾脏、肾脏、肝脏、心脏、扁桃体和淋巴结眼观无明显病理变化，且3组间无显著差异；对肺脏进行病理组织学检测发现，肺泡结构正常、清晰，3组间无显著差异，未见间质性肺炎的病理损伤，结果见表2。

3 讨论

临床上，使用弱毒活疫苗免疫接种是我国对于CSF和HP-PRRS采用的最主要的防控手段。因此，HP-PRRS和CSF的两种疫苗均被广泛应用于猪场的猪只免疫中，但是猪场多种疫苗同时使用以及高频次的免疫接种，增加了猪只的免疫负担，还经常发生不同的疫苗相互干扰，这都会影响疫苗的免疫效力，很难获得较好的免疫效果。因此，本团队利用反向遗传技术，研发了表达CSFV E2蛋白的重组PRRSV基因工程疫苗rPRRSV-E2。目前该疫苗前期研究表明，其能够对HP-PRRSV和CSFV提供完全的免疫保护。另外，母源抗体干扰试验的初步结果表明，rPRRSV-E2不受PRRSV和CSFV母源抗体的干扰。

表2 各试验组剖检病理学变化Table 2 Pathological examination of piglets in different groups

对于弱毒活疫苗来说，毒株安全性是疫苗的第一重要指标，除了采用安全性检验和毒力返强试验来评估外，疫苗病毒的水平传播能力也可作为安全性评估的重要依据[11-12]。任何事物都具有两面性，疫苗病毒的水平传播也是这样，疫苗病毒水平传播可以弥补疫苗免疫接种遗漏的问题，使整群动物均获得免疫保护能力，但疫苗病毒如果较长时间在动物间传播，会增加毒力返强的风险[10,13-14]。

因此，本研究中开展了rPRRSV-E2的水平传播试验，结果表明rPRRSV-E2免疫的猪群不会向外界排毒，不能在猪群间水平传播，具有良好的安全性。表达CSFV E2蛋白的重组PRRSV基因工程疫苗候选株rPRRSV-E2不仅可达到“一针防两病”的效果，对于CSF来说，rPRRSV-E2还是一种DIVA（differentation between infected and vaccinated animals）疫苗[15-18]。免疫后，可以通过CSFV Erns抗体检测试剂盒与野毒CSFV感染进行血清学的鉴别诊断，将有利于我国猪群中CSFV的控制和净化。综上所述，rPRRSV-E2的成功研发具有重要的应用价值和现实意义。