白酒糟醅微生物多样性的研究进展

刘 芳，杨康卓，张建敏，乔宗伟，安明哲，郑 佳，赵 东

(宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾 644007)

白酒是我国传统的蒸馏酒，与白兰地、威士忌、朗姆酒、伏特加、金酒并称为世界六大蒸馏酒[1]，白酒是以粮谷类为原料(如高粱、大米、糯米、玉米、小麦等)，以大曲为糖化发酵剂，经发酵、蒸馏、贮存、勾调等工艺制成的蒸馏酒。在传统固态白酒的酿造过程中，微生物群落呈现复杂的多样性，对白酒产量、品质以及风味起着至关重要的作用。过去，人们通过培养组学方法对白酒酿造过程中的主要微生物进行分析，通过观察菌群外观形态、理化特征和计算菌落数量来确定微生物群落的种类和数量。近年来，随着生物化学和分子生物学技术的不断发展，用于白酒发酵过程中微生物多样性的研究方法层出不穷，运用非培养的生理生化方法与现代分子生物学技术对白酒酿造微生物群落进行更全面而深入的研究，使得人们对白酒发酵过程中微生物动态变化与酒质的关系有了新的认识，为深入了解白酒固态发酵机理提供了基础数据，为改进生产工艺提供了理论参考。

本文综述了不同香型白酒糟醅发酵过程中微生物群落多样性的研究方法，并对研究结果进行综述，以期为深入分析白酒发酵机理提供新思路。

1 发酵过程中糟醅微生物动态变化规律

白酒的酿造是大曲/大曲+窖泥(浓香型白酒)中庞大的微生物区系以糟醅为能量来源和基质发生有序的消长和能量代谢的过程。糟醅中微生物的组成、分布及其消长规律对白酒产量和品质具有重要影响。研究表明，随着发酵的进行，糟醅中微生物群落在时空分布具有明显差异；不同香型白酒由于生产工艺的不同，微生物群落分布及变化规律也各不相同。近年来，国内学者对白酒固态发酵糟醅微生物群落变化规律已经做了大量研究，部分研究结果见表1。

2 糟醅微生物群落研究方法及进展

2.1 传统培养方法

早期对糟醅中微生物的研究多采用传统微生物培养方法分离鉴定糟醅中可培养微生物，分析白酒糟醅微生物种群结构，探索功能菌株在发酵过程中的消长变化。乔宗伟等[17]对窖池酒醅中不同空间位置的微生物区系进行了动态分析，初步了解了浓香型白酒窖池酒醅不同层面、不同区域微生物数量的分布及变化趋势：分离获得113 株细菌，经16S rDNA 鉴定细菌可分为11 个属，其中芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)为优势类群；分离得到92 株酵母菌，经鉴定分为14 个属，其中复膜孢子酵母属(Saccharomycopsis)和伊萨酵母属(Issatchenkia)在入窖样中数量非常多，为主要优势菌；分离得到32 株霉菌类菌株，经鉴定主要有犁头霉属(Absidia)、曲霉属(Aspergillus)等。吴飞等[18]从发酵7 d 的浓香型白酒糟醅中分离得到84 株酵母，经形态学、生理生化与18S rDNA 鉴定将其归为6 个类群，其中伊萨酵母属(Issatchenkia)和毕赤酵母属(Pichia)为优势类群，巴德利酵母属(Debaryomyces)和假丝酵母属(Candida)也占有一定的比例。张霞等[19]从贵州浓香型白酒窖泥和糟醅中分离到477株细菌，经鉴定地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)占总芽孢杆菌数的32.96 %，为芽孢杆菌属优势类群，同时还分离得到极少量的短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的不确定种菌株。将研究结果与四川浓香型白酒细菌群落比较，发现微生物类群相似。孙剑秋等[20]对酱香型北大仓酒醅中霉菌多样性进行分析，从酒醅样品中分离得到328 株霉菌，经鉴定分属于13属23种，其中曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)霉菌的数量较大，链格孢(Alternaria)、地霉(Geotrichum)、曲梗霉(Geniculosporium)、帚霉(Scopulariopsis)、葡萄穗霉(Stachybotrys)和毛霉(Mucor)等在酒醅发酵某个阶段的相对丰度在10 %以上。王薇等[21]运用WL 鉴别培养基和26S rRNA D1/D2序列分析方法对清香型白酒酒醅发酵过程中酵母菌群落进行分析，从清香型白酒固态酿造过程中共鉴定出10 种酵母，发酵前期优势酵母菌为孢汉生酵母(Hanseniaspora osmophila)与膜璞毕赤酵母(Pichia membranifaciens)，发酵后期优势酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。曾驰等[22]从白云边酒高温堆积酒醅中分离得到6 株不同细菌，根据16S rDNA 序列进行系统发育分析，发现芽孢杆菌属(Bacillus)为主要的细菌。

表1 不同香型白酒糟醅微生物变化规律

虽然传统培养法是获得有益微生物的唯一途径，但是自然界中仅有不到1%的微生物可培养[37]，采用传统微生物分离鉴定方法分析白酒糟醅微生物多样性存在一定的局限性，同时传统培养法的培养环境与微生物原位生长环境存在巨大偏差，无法完全真实反映发酵过程中环境的胁迫、微生物之间的相互关系，尤其是培养基对微生物的生长的选择性。

2.2 免培养生理生化方法

2.2.1 PLFA法

磷脂脂肪酸(PLFA)图谱分析法是一种研究微生物群落结构的快捷方法，主要用于微生物生物量的评价，该方法快速、简便、重现性好，因而被广泛应用于土壤[23]、淤泥[24]及窖泥[25]等复杂体系中微生物群落分析[26]。

郑佳等[27]对不同窖龄浓香型白酒窖池PLFA 分析，结果表明，不同窖龄窖池中的微生物群落结构呈现较为显著的差异，5 年窖窖泥、糟醅和黄水中真菌PLFA含量均高于其他窖龄相应样品。徐泽江等[28]应用PLFA 分析方法对芝麻香型白酒堆积过程微生物生物量和群落结构进行分析，结果显示，整个堆积过程，PLFA 的种类和数量呈现一定的变化规律，其中优势PLFA 为直链饱和脂肪酸和偶数碳不饱和脂肪酸。细菌是整个堆积过程的优势微生物菌群，革兰氏阴性菌是细菌中的优势菌群。钟姝霞等[29]从酱香型白酒中分离筛选出5株产香芽孢杆菌，经PLFA 鉴定分别为：蜡样芽孢杆菌(Bacillus ereus)、泛酸枝芽孢杆菌(Virgibacillus pantothenticus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。刘琨毅等[30]的研究结果显示，基于指纹图谱能够表征糟醅微生物群落结构特征及动态变化，对多家酿酒企业糟醅PLFA 组成的检测结果证实该法在白酒糟醅中应用的普适性。

2.2.2 Biolog微平板分析法

Biolog 技术是由Biolog 公司开发的一种自动化鉴定微生物群落的技术。其测定原理为：微生物在利用碳源过程中产生的自由电子，与四唑盐染料发生还原显色反应，颜色的深浅反应微生物对碳源的利用程度[31]。由于该方法灵敏度高、分辨率强、自动化标准化程度高等优点，被广泛应用于微生物功能及群落多样性研究[32-34]。李光辉等[35]采用Biolog 平板法对浓香型白酒糟醅微生物群落代谢特性进行研究，结果表明，发酵过程中，下层糟醅微生物群落代谢活性呈先降后升的变化趋势，微生物功能多样性的增加与pH 值的显著降低之间存在着重要联系。陈林[36]采用Biolog 微平板培养法对酱香型白酒发酵阶段微生物群落进行分析，结果显示，微生物活性随培养时间的延长而提高。

Bolog微平板法应用于白酒发酵过程中微生物多样性分析，为了解微生物发酵过程中微生物多样性提供了快速有效的手段，但该方法具有一定的局限性：仅能鉴定快速生长的微生物，而且测定结果受多种因素的影响。

2.2.3 FISH法

荧光原位杂交(FISH)技术是一种非放射性原位杂交技术，其原理是以荧光标记的核苷酸单链为探针，基于碱基互补配对原则，探针与未知的单链核苷酸序列进行特异性结合形成杂交双链，使用光密度测定法直接比较核酸杂交条带或斑点从而获得定量结果。FISH 技术可进行样品的原位杂交，已成功运用于非培养微生物的检测以及细菌群落的多样性分析[37-38]。该技术也被应用于白酒发酵过程中微生物群落多样性研究。Li 等[39]结合磷脂乙醚油脂(PLEL)/PLFA 分析与荧光原位杂交技术对浓香型白酒不同窖龄窖泥、糟醅及黄水细菌和真细菌群落进行定量分析，并采用变性梯度凝胶(PCRDGGE)进行定性分析，结果表明，窖泥、糟醅及黄水三相中微生物群落差异显著，厌氧菌和革兰氏阳性菌为主要菌群；微生物群落之间的相互作用，特别是真菌群和产甲烷菌群之间的相互作用，在白酒发酵过程中起着关键作用。

2.3 基于PCR的指纹图谱法

2.3.1 DGGE技术

变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是分子生物学分析中常用的方法之一，其原理是利用丙烯酰胺凝胶中变性剂梯度，使片段长度相同但碱基组成不同的PCR 产物得到分离。凝胶上DNA 条带数量及强度反映微生物群落的多样性，通过将切胶回收所得条带序列与DGGE 指纹图谱对比分析，最终获得样本微生物群落结构的整体信息。由于该技术具有准确、高效、检测限低等优点，被广泛应用于环境微生物群落结构分析。在白酒研究领域，DGGE 技术也被广泛应用于白酒发酵过程中微生物群落多样性研究，Zhang 等[40-41]对浓香型白酒发酵过程中真菌及细菌多样性进行分析，结果发现，发酵过程中伊萨酵母属(Issatchenkia)、踝节菌属(Talaromyces)曲霉菌属(Aspergillus)为主要优势真菌，同时，随着发酵的进行，糟醅细菌多样性下降，其中耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)在发酵过程中为优势微生物。李德林等[42]研究了浓香型白酒糟醅微生物群落结构发现，浓香型白酒糟醅中检出细菌18个属，首次检出Dyadobacter属、Pantoea属、Pediococcus属、Saccharomonospora属、Bavariicoccus属、Serratia属、Petrimona属、Exiguobacterium属菌株；对DGGE 图谱相似性的分析结果显示，样本图谱间相似性指数较低，季节及水质等因素对微生物群落结构具有较大影响。Chen 等[43]从酱香型白酒糟醅中鉴定出7 种丝状真菌，其中P.variotii与A.oryzae具有较强的产淀粉酶能力。谭映月[44]研究了酱香型白酒发酵过程中糟醅细菌多样性，发现芽孢杆菌属(Bacillus)和乳杆菌(Lactobacillus)为发酵过程中优势微生物。徐瑾等[45]对清香型白酒细菌多样性进行研究并优化了PCR-DGGE条件。Wang等[46]采用DGGE 与16S rRNA 克隆文库方法对比研究了浓香型和芝麻香型白酒酒醅在发酵过程中的微生物菌群结构，DGGE 图谱发现，糟醅中微生物多样性随发酵不断降低，发酵后期Lactobacillus manihotivorans成为优势菌群；16S rRNA 克隆文库发现，浓香型和芝麻香型酒醅中的微生物种属差异较大。

2.3.2 荧光定量PCR技术

荧光定量PCR 技术，是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，分析扩增循环产物的荧光信号，最后通过标准曲线定量分析样品模板，推断目标基因的初始量[47]。该方法具由灵敏度高、准确性高、特异性强、安全快速等优点[48]被广泛应用于微生物生态学研究。路虎等[49]发现，该方法能够对白酒固态发酵过程中产土味素链霉菌进行定量分析。黄丹等[50]对白酒发酵糟醅耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)与东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)进行分析，结果发现，发酵中期这两种微生物数量均高于发酵后期，在同一发酵期，靠近窖壁的数量高于窖内。陈笔等[51]以白酒酿造中常用的塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)为例，建立一套快速准确定量塔宾曲霉生物量的方法。孙超等[52]利用该技术及预测微生物学建立可培养酿酒微生物资源数据库和预测微生物学数学模型。

2.3.3 SSCP技术

单链构象多态性（SSCP）技术的原理是：相同长度的单链DNA 因碱基序列的不同，形成的构象有所差异，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，不同的DNA 单链即可形成分离的条带。该技术在白酒发酵过程中的微生物群落研究中被广泛应用[53-55]。冯治平[56]对浓香型白酒酒醅发酵过程中古菌群落进行研究，结果显示，酒醅中古菌的SSCP图谱具有较高的相似性指数，表明古菌群落在发酵过程中的变化较小。海娜[57]对浓香型白酒糟醅原核微生物群落进行分析，获得的SSCP 图谱条带介于11～19条，不同发酵时间的原核微生物群落具有较大差异。

PCR-SSCP 技术在研究微生物群落及评价微生物结构变化具有直观、方便的优点，实验过程中只需普通引物实验设备简单操作简单。但SSCP图谱分析结果与群落实际结构存在一定误差，这主要是基因组DNA 提取方法与PCR 选择性放大造成的偏差，另外，该技术检测的灵敏度与DNA 片段长度有关，片段度增加灵敏度降低[58]。

2.3.4 T-RFLP技术

末端限制性片段长度多态性（RFLP）作为第一代分子生物学标记，其原理为：不同生物体或种群间DNA 片段酶切位点不同，DNA 限制性内切酶具有识别特定的DNA 序列并在特定的部位切断DNA 双链的活性功能，利用限制性内切酶进行消化，可得到长短、种类、数目不同的限制性片段。该基于RFLP 技术发展而来的T-RFLP 技术被广泛应用于群落结构及多样性分析[59]。T-RFLP 技术用荧光引物对引物一端进行标记，仅需分析被标记的末端限制性片段，根据检测到的带有荧光标记的DNA 片段与已有数据库进行比对，从而判断样本微生物多样性，根据荧光强度的强弱能够确定物种的丰度。由于该技术具有重复性好、分辨率高，且能对物种丰度进行分析，被广泛应用于发酵食品微生物多样性研究[60-61]及白酒大曲、糟醅多样性研究。Wu 等[62]研究了茅台糟醅发酵过程中的酵母群落，发现拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、膜璞毕赤酵母(Pichia membranifaciens)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)存在于整个发酵过程中，是发酵过程中的优势菌群；发酵过程中各层酵母菌数量明显不同，主要表现为上层酵母菌总数大于中下层，且酵母菌数量与还原糖减少量及乙醇生成量具有明显的相关性。

2.4 高通量测序技术

高通量测序技术，又称“第二代”测序技术，是现今应用最广泛的测序技术，该技术能一次并行测定几十万到几百万条DNA 分子序列，且一般读长较短，能够深入、细致全貌的分析一个物种的转录组和基因组。2005 年，454 Life Science 公司首先推出了基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河，但由于其通量低、成本高等缺点，目前已退出市场。随着对测序技术的改进，Illumina 公司与ABI 公司相继推出了Solexa和SOLID 测序技术占据主流地位[63-64]。近年来，高通量测序技术被广泛应用于发酵食品菌群多样性研究[65-66]，同时，越来越多的研究者将这一技术应用于白酒酿造过程中微生物多样性的研究。Wang 等[67]采用16S rRNA 扩增子测序技术分析了糟醅、窖泥和大曲中的原核生物群落，结果表明，大曲中微生物对糟醅发酵的影响主要表现为发酵前期，窖泥中微生物对发酵糟醅的作用存在于整个发酵过程中；大曲、糟醅及窖泥中共鉴定出299 个属，以乳酸菌属(Lactobacillus)、白串珠菌属(Leuconostoc)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、石化菌属(Petrimonas)、梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、甲烷菌属(Methanobacterium)和甲烷杆菌属(Methanobrevibacter)10 个属为主。Huang等[68]采用454焦磷酸测序技术对浓香型白酒和酱香型白酒发酵过程中细菌与真菌微生物多样性、功能进行综合分析，分别从酱香型中鉴定出细菌315属、真菌72 属，从浓香型中鉴定出细菌83 属、真菌47属；使用PICRUSt软件对发酵过程中细菌群落功能进行预测，选择丰度前50 的代谢通路进行分析，预测结果显示，浓香型白酒糟醅与酱香型白酒糟醅在能量、碳水化合物、氨基酸的代谢通路上具有明显差异。表2 列举了部分高通量测序技术在白酒糟醅微生物多样性研究中的应用。

表2 高通量测序技术在白酒糟醅微生物多样性研究中的应用

3 展望

白酒酿造过程中，微生物群落的多样性直接关系到白酒的品质与风味。近年来，随着生物学技术的快速发展，使人们对白酒酿造过程中微生物多样性有了更加深入的了解。现阶段，对于白酒糟醅微生物群落多样性及发酵过程中风味物质变化规律已有大量报道，其中涉及微生物群落结构解析与风味物质关联的研究一直是白酒研究的一个重要领域，但至今仍没有形成一个完备的理论支撑体系。应用现代分子生物学及培养组学理论技术探究白酒酿造过程中微生物多样性及生理功能，并结合风味代谢组学进一步深入分析风味物质形成机理，从而科学指导白酒酿造，提高白酒优质品率等，这无疑将是我国白酒研究的重要途径之一。