红心猕猴桃果酒抗氧化及抑制人肝癌HepG2细胞增殖活性研究

秦晋颖 ，谢晓林，朱 燕，许译文，刘志刚，蔡 倪，韩 琳

（1.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳 550005；2.贵州省轻工业科学研究所，贵州贵阳 550007）

贵州六盘水红心猕猴桃果肉颜色鲜艳，口感香甜细腻，营养丰富，深受广大消费者的喜爱。目前红心猕猴桃市场主要集中于鲜果生产及销售，加工产品种类和数量有限，通过红心猕猴桃果酒开发，提升产品附加值是促进当地种植农户增收的有效途径。猕猴桃果酒是以新鲜猕猴桃果实或果汁为原料，经发酵而成的一种低度酒，采用原汁发酵，保留了猕猴桃水果最初的果香，酸甜适中，同时在酿造过程中，酵母代谢及酶促作用分解了部分大分子物质，使果酒中含有丰富的功能成分，入口醇厚、爽口，因风味独特并富含多种营养物质，在众多果酒产品中独树一帜，市场前景广阔[1-3]。

尽管类型众多的果酒打着营养保健功能的旗号大行其道，然而具体营养成分、含量及功能性并不明确，果酒卖点宣传模糊，针对性不强。与此同时，食品已经日益成为发现生物功效成分的重要途径，有学者对沙果果酒和葡萄酒等产品中的生物活性进行了研究[4-6]，目前有关猕猴桃果酒的生物功能研究有限，本研究以贵州六盘水红心猕猴桃果酒为对象，对其抗氧化及抗肿瘤活性进行初步探究，以期为提升红心猕猴桃加工产品附加值，为当地经济发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

试样：红心猕猴桃果酒样品由六盘水凉都猕猴桃集团公司提供。

试剂及耗材：DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS（2,2-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐）、维生素C、没食子酸、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、DMSO 均为分析纯，乙醇、盐酸和甲醇等，购自上海国药集团化学试剂有限公司，试验用水为二次重蒸水。The CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent (MTS 试剂) 和luciferase 测试试剂盒购自Promega 公司(Madison,WI,USA)。改良型DMEM 高葡萄糖培养基购买于Sigma 公司，胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco 公司，肝癌HepG2细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

仪器设备：UV-2550 型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；酶标仪，美国Thermo Electron 公司；旋转蒸发仪，RE-52A 型，上海亚荣；MA110 型分析天平，上海良平仪器仪表；DL-166RH 型高速离心机，上海安亭科学仪器厂；SPX-250B-Z 生化培养箱，上海博讯实业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DPPH自由基清除能力测定

参照文献方法[5-6]，以没食子酸为标准物质绘制标准曲线，取酒样用乙醇稀释20 倍，取酒样稀释液2.0 mL，加入0.2 mM DPPH 乙醇溶液2.0 mL，摇匀，避光静置45 min，以乙醇为空白，于517 nm 处测定吸光度，另取2.0 mL 乙醇与2.0 mL DPPH 乙醇溶液混匀，相同波长处测定吸光度值，每份样品平行操作3 次，根据没食子酸标准曲线回归方程，计算样品清除DPPH 自由基的能力。

1.2.2 ABTS+自由基清除能力测定

参照文献方法[7-9]，分别取250 μL、200 μL、150 μL、100 μ L、50 μ L酒样置10 mL容量瓶中，乙醇稀释定容。将不同浓度的酒样2.0 mL 与2.0 mL ABTS+反应液混合均匀，暗处反应5 min，于734 nm 波长处测定吸光度值为A1，用蒸馏水代替酒样与ABTS+混合均匀测定吸光度值为A0，依文献中公式计算ABTS自由基清除率，并通过统计软件计算IC50值。

1.2.3 HepG细胞活力测试

MTS 测试[10-12]：将人肝癌HepG2-C8 细胞培养于细胞培养液中（10 %胎牛血清DMEM 培养基），置于37 ℃、5%CO2培养箱培养，随行细胞计数，待细胞计数达1×106左右，加入2.0 mL 0.25 %胰蛋白酶-EDTA 溶液于培养箱中消化细胞2 min，加入DMEM 培养基适量后转移至离心管中，将所收集细胞液以3000 r/min 转速离心3 min，弃掉上清液，加入细胞培养液悬浮细胞，吹打均匀，以5000 个细胞/孔接种于96 孔培养板，置于37 ℃、5 % CO2的培养箱培养24 h。

将猕猴桃果酒不同浓度提取物及阳性对照用DMSO 溶解，用1%FBS 细胞培养液稀释成不同浓度梯度。实验设空白组和实验组，空白组为0.1 %DMSO 细胞培养液100 μ L；实验组加入不同浓度（12.5 μM、25.0 μM、50.0 μM、100.0 μM、200.0 μM）果酒提取物100 μ L，每个浓度梯度设3 个复孔，在37 ℃、5 % CO2培养箱中培养24 h 后弃去培养液，每孔加入100 μ L 含适量MTS 测试液细胞培养液，铝箔纸包裹后置于培养箱继续培养1 h，酶标仪于检测波长520 nm 处测定每孔吸光度值，计算细胞增殖抑制率，以上实验组分别测试给药1 d、3 d、5 d。

1.2.4 Luciferase-ARE测定

HepG2 细胞来源于肝癌细胞的粘附性上皮样细胞，常用于研究细胞保护、抗遗传毒性和协同基因毒性的工具。本研究通过测定Luciferase 活性，研究猕猴桃果酒提取物激活Nrf2信号通路的能力，从而为阐述其潜在的抗肿瘤活性作用机理奠定基础。测试方法参考文献[12]，用12 孔板隔夜培养HepG2-c8 细胞，以每孔1×106个细胞密度种板，莱菔硫烷（SFN）作为阳性对照，采用0.1 % DMSO 和不同浓度的猕猴桃果酒提取物处理细胞24 h，移除培养基，用PBS 清洗细胞，加入100 μ L 裂解缓冲液，经-80 ℃冻融循环后于冰台上刮取细胞，4 ℃冷冻离心机10000 r/min 离心10 min，取上清液，加入50 μ L Luciferase 测试试剂，在Luminometer 发光仪上读取吸光值，通过所测得BCA 蛋白浓度进行相应计算。

表1 猕猴桃果酒提取物抗氧化作用

1.2.5 数据统计分析

采用GraphPad Prism 8 软件对数据进行统计分析，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用Student's t-test 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 红心猕猴桃果酒抗氧化能力

从表1 中测定结果可看出，猕猴桃果酒提取物对DPPH 自由基有一定的清除能力，IC50值为58.32 μg/mL，而阳性对照VC的IC50值为11.27 μg/mL，说明其清除效果大大低于VC。同样，猕猴桃果酒提取物对ABTS+自由基的清除能力也低于VC，其IC50值分别为32.56 μ g/mL 和5.76 μ g/mL，综上，猕猴桃果酒提取物有一定的抗氧化活性，但效果一般。

2.2 人肝癌HepG2细胞抑制率

分别于给予猕猴桃果酒提取物第1 d、3 d、5 d进行细胞活性测定，从图1 可看出，猕猴桃果酒提取物给药组HepG2细胞活力均有明显下降，且表现出时间和剂量依赖性，猕猴桃果酒提取物200 μ M处理5 d 后，HepG2 细胞活力均在70 %左右，表明猕猴桃果酒提取物对HepG2 细胞具有一定的抑制作用，该剂量被选择用于随后的实验。

2.3 Luciferase-ARE测定

测定结果见图2，可以看出猕猴桃果酒提取物诱导荧光素酶表达无剂量依赖性，与对照组相比，分别以62.5 μ M 和125 μ M 猕猴桃果酒提取物处理后，荧光素酶表达量分别为对照组的3.46 倍和3.78倍，SFN (10 μ M)阳性对照处理后荧光素酶活性大幅增加9.74 倍，与预期一致，表明猕猴桃果酒提取物可以激活Nrf2信号通路，进而调节抗氧化基因的转录。基于每组蛋白质浓度计算得到荧光素酶表达，与对照组相比各组间均P＜0.05，具有统计学意义。

3 讨论

3.1 有文献报道猕猴桃具有抗氧化功效[13-16]，目前对于红心猕猴桃的研究主要集中在以VC为代表的成分测定和深加工产品开发等方面，有关其他功效成分及生物活性研究鲜见文献报道，通过本研究发现，红心猕猴桃果酒提取物对DPPH 自由基和ABTS+自由基具备一定的清除能力，但其清除能力较弱，与VC 相比较，猕猴桃果酒提取物没有体现出显著的抗氧化活性。

3.2 本研究首次对红心猕猴桃抑制肝癌HepG2 细胞体外增殖活性进行了研究，猕猴桃果酒提取物200μ M 处理5 d 后，HepG2 细胞活力降至70 %以下，表明猕猴桃果酒提取物对HepG2细胞具有一定的抑制作用，具备潜在抗癌活性，进一步研究发现，激活Nrf2 信号通路进而调节抗氧化基因的转录是其抑制肝癌HepG2细胞可能的作用机理。