不同保存条件对鸡精液体外保存和人工授精效果的影响

李承德 ，周乐乐，高凤磊，黄康法，严常燕，黄晓刚，范玉珊，张发良，李 莉，郑熙灿，张守全，卫恒习*

（1.华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广东广州 510642；2.广东农工商职业技术学院，广东广州 510507；3.佛山市南海种禽有限公司，广东佛山 528222）

鸡的人工授精产生于20 世纪30 年代，Burrows 等[1]首先建立了鸡的按摩法采精技术并一直沿用至今。1977年，Sexton[2]发明了一种磷酸盐稀释液BPSE（Belsville Poultry Semen Extender），在家禽精液保存中得到广泛应用。未稀释的家禽精液受精力会迅速丧失，稀释后可延长精液体外保存时间；鸡精液体外保存效果受稀释液种类、保存温度等条件影响[3]。Sexton[2]和Lake 等[4]将稀释后的鸡精液保存在2～5℃条件下24 h，输精后获得较好的受精率。人工授精技术有助于提高优良种公鸡的利用效率和养鸡生产的经济效益，因此被广泛应用于集约化规模化种鸡场。但在实际生产中，鸡人工授精技术仍存在诸如劳动量大、精液保存时间短等问题，致使有些鸡场仍使用原精输精，精液利用效率降低，受精率下降、采精劳动强度增加[5-6]。

鸡精液稀释与保存是人工授精技术的关键环节，虽然国内外学者在稀释液开发和精液保存上做了大量工作，但效果仍不理想，保存6 h 后精子活率普遍较低[3]。鸡精液密度大、易发生凝集、体外存活时间短，只有经过稀释处理才能进行有效的保存和运输[7]。精液体外保存效果受到稀释液成分、渗透压、pH、精液稀释比例、保存温度等多种因素的影响[3]。近年来研究表明，稀释液中添加适量的褪黑素等抗氧化剂有助于提高猪、羊、鸡的精液保存时间与精子活力[3,8-9]，但对人工授精效果的影响仍不明确。本研究针对我国南方夏季热应激造成种公鸡精液品质下降的问题，探索不同保存温度、不同稀释比例以及添加褪黑素对鸡精液体外保存及人工授精效果的影响，以期建立适宜的精液稀释与保存技术，来满足夏季种鸡场人工授精的技术需求，同时为我国南方地区种鸡场人工授精技术的推广应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 精液采自33 周龄的黄羽种公鸡，并立即将不同公鸡的精液混匀、备用。褪黑素购自Sigma 公司，用PBS 配成1 mmol/L 浓储液，-20℃保存备用。稀释液Ⅰ参照胡艳娟[10]报道的配方进行配制，4℃保存。稀释液Ⅱ在稀释液Ⅰ的基础上，添加褪黑素0.5 μmol/L，现用现配。

1.2 实验设计 本实验于2019 年7—9 月在广东某种鸡场进行，选用同一鸡舍的成年黄羽种公鸡21 只、黄羽种母鸡400 只进行实验，实验种蛋在公司的孵化场进行孵化。首先将采集的公鸡精液进行不同比例（1:1、1:2、1:3）稀释，然后分别在4℃和37℃条件下保存不同时间（0、4、8、24 h）再进行精子活力检测，同时以鸡场不进行稀释的原精输精为对照，对不同稀释液（稀释液Ⅰ、稀释液Ⅱ）、不同稀释比例和不同保存时间的4℃保存精液分别进行人工授精和种蛋受精率的检测。

1.3 实验方法

1.3.1 精液采集与稀释 采用背腹按摩法采集公鸡精液，室温混匀；在37℃下进行常规精液品质检查并记录精子活力。然后按照试验设计将精液平均分装到6 个离心管中，分别用稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ在37℃等温条件下分别进行1:1、1:2 和1:3 稀释，轻摇混匀。再将稀释后的每份精液平均分成2 管，分别置于37℃和4℃条件下保存。

1.3.2 精液保存与活力检测 于4℃和37℃条件保存的精液，分别在不同保存时间（0、4、8、24 h）进行精子活力检查。具体操作是将精液轻轻混匀，取一小部分于1.5 mL 离心管中，置于37℃恒温加热板上；将载玻片和盖玻片放在37℃恒温板上预热5 min，取1 滴精液滴在载玻片，盖上盖玻片，立即在显微镜下观察并记录精子活力。精子活力采用十级评分法，观察视野中直线前进运动精子的所占的比例。试验重复5 次以上。

1.3.3 人工输精与种蛋孵化 以鸡场不进行稀释的原精输精为对照，对不同稀释液（稀释液Ⅰ、稀释液Ⅱ）、不同稀释比例（1:1、1:2 和1:3）和不同保存时间（0、4、8、24 h）的4℃保存精液分别进行人工授精试验。将400只母鸡随机分为25 组，每组16 只母鸡。一组为对照组，用原精液进行输精；其他24 组为试验组，分别输入不同处理保存的精液（2 种稀释液×3 个稀释比例×4 个保存时间）。母鸡的输精剂量为0.03 mL/只，间隔5 d输精1 次。在对母鸡进行第3 次输精的次日开始收集种蛋并做好组别标记，连续收集7 d，种蛋临时保存在16℃的贮蛋室，待收集完成后一起入孵。入孵之前清洗好试验种蛋并消毒，孵化温度为37.8℃，相对湿度为55%。在入孵后第18 天照蛋，第21 天出苗。观察和记录每组的未受精蛋数、死胎蛋数、出苗数、健雏数等指标。种蛋受精率=受精蛋数/入孵种蛋数×100%，出苗率=出苗数量/受精蛋数×100%，健雏率=健雏数/总出雏数×100%。试验重复3 次以上。

1.4 统计分析 实验数据用Excel 软件进行整理，结果以平均值±标准误表示，采用SPSS 23.0 进行单因素方差分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同稀释液及保存温度对鸡精液精子活力影响 由图1 可知，不同稀释液对精子活力没有影响，不管4℃低温保存还是37℃常温保存，稀释精液的精子活力随保存时间的延长而降低，但4℃保存效果优于37℃保存（P＜0.01）。在4℃条件下，稀释精液保存0、4、8 h 精子的平均活力分别为0.73、0.70 和0.65（P＞0.05），但保存24 h 的精子活力（0.51）显著或极显著低于其他时间点。

2.2 不同稀释比例对鸡4℃低温保存精液精子活力的影响由表1 可知，不同稀释比例各组的精子活力均随着保存时间的延长而降低。在相同稀释比例下，保存0 h 和4 h的精子活力极显著高于保存24 h，而保存0、4、8 h 的精子活力差异不显著。在相同保存时间下，不同稀释比例对4℃低温保存精液的精子活力均没有显著影响，但随着稀释比例的增加而呈下降趋势。

表1 不同稀释比例对鸡低温保存精液精子活力的影响

2.3 不同稀释液对鸡人工授精的种蛋受精率、出苗率和健雏率的影响 如表2 所示，不同稀释液对4℃保存的稀释精液的人工授精种蛋受精率、出苗率和健雏率均无显著影响。不同稀释液保存0、4、8 h 的种蛋受精率、出苗率和健雏率均无显著差异，但种蛋受精率均高于原精输精组，表明精液稀释有助于提高鸡人工授精的种蛋受精率；保存24 h 时，稀释液Ⅰ组和稀释液Ⅱ组的种蛋受精率均显著降低。

在保存0～8 h 时，2 种稀释液的出苗率和健雏率没有显著变化；但保存24 h 时，其出苗率和健雏率均显著性低于其他保存时间组和原精输精组。

表2 入孵种蛋数和不同稀释液对种蛋受精率、出苗率及健雏率的影响

2.4 不同稀释比例对鸡人工授精的种蛋受精率、出苗率和健雏率的影响 如表3 所示，在保存时间相同的情况下，不同稀释比例的保存精液，其种蛋受精率存在显著差异。当保存0 h 时，1:1 和1:2 稀释组的种蛋受精率显著高于原精输精组；当保存8 h 时，1:3 稀释组的受精率显著低于1:1 稀释组；而当保存24 h 时，不同稀释比例各组的受精率与保存0、4、8 h 组相比均极显著降低，其中1:3 稀释组的受精率最低，显著或极显著低于其他各组。

不同稀释比例各组精液在4℃保存0、4、8 h 对出苗率和健雏率没有显著影响；但保存24 h 则会显著降低出苗率和健雏率。综合来看，精液稀释比例为1:2 时效果较好，在4℃保存0～8 h 不会对人工授精效果产生不良影响，并能扩大鸡精液的利用效率。

3 讨 论

我国南方夏季炎热多雨，局部地区温度可达40℃，热应激造成的公鸡精液品质下降问题普遍存在。精液保存温度影响精子的代谢速率，随着精液保存时间的延长，精子代谢不仅消耗大量的能量物质，而且产生大量代谢产物，如乳酸、活性氧（ROS）等，进而影响精子活力和受精能力[11-13]。本研究发现4℃保存24 h 的精液平均精子活力都在0.5 以上，是适宜的鸡精液保存温度。

精子呼吸代谢产生ROS，可以氧化精子质膜的不饱和脂肪酸，使精子受精能力下降[13]。褪黑素具有较强的抗氧化作用，可以减少ROS 含量，降低氧化损伤[14]。褪黑素的抗氧化作用与其添加浓度有关，在绒山羊精液冷冻稀释液中添加0.5 mg/mL褪黑素能够显著提高绒山羊精子抗氧化能力和冷冻保存效果[15]。在猪精液中添加0.1 μmol/L褪黑素可以显著提高精液体外保存质量和受精能力[16]。李洁等[7]报道，低浓度褪黑素（1.0 μmol/L）有助于延长鸡精液低温保存的存活时间，但高浓度褪黑素（3.0 μmol/L）则不利于精子存活。本研究发现，在精液中添加0.5 μmol/L褪黑素对鸡精液体外保存以及人工授精效果均没有显著影响，可能是添加量不足所致。

鸡精液精子密度高，对精液进行适当稀释可增加精液量，充分发挥优质种公鸡的繁殖性能，降低公鸡饲养量，符合种鸡场提高生产水平的需求。若采用原精输精，则公鸡母鸡比例为1:30；若将原精液稀释后进行人工输精，则公鸡母鸡的比例为1:60～1:90[17]。由于鸡的输精量较少，通常为0.03 mL，因此精液稀释比例不宜过大。潘越博等[18]对鸡精液进行1:1、1:1.5、1:2 稀释，发现3 组间受精率没有显著差异，但精液稀释后受精率显著高于原精液。本研究也发现，稀释精液人工授精的受精率显著高于原精授精组。但稀释精液的体外保存和人工授精效果受到保存时间的影响，随着保存时间的延长而降低。在相同保存时间下，精子活力和受精率随稀释比例增加而呈下降趋势，但稀释比例对出苗率和健雏率没有显著影响。在保存8 h 和24 h，1:3 稀释保存组的受精率显著降低，这可能是输精的有效精子数量降低所致。总体来看，1:2 稀释组的效果较好，更适合鸡场实际生产。

表3 入孵种蛋数和不同稀释比例对种蛋受精率、出苗率及健雏率的影响

延长精液保存时间是种鸡场人工授精的迫切需求，除了优化保存条件外，还可以不断优化精液稀释液配方来实现延长精液保存时间。秦国栋等[19]用生理盐水对精液进行稀释，发现精液最长保存时间为2 h。Sexton[2]研究发现，保存 0、4、24 h，保存5℃条件下并暴露于可见光的鸡精液稀释液与对照组的受精率相同，而精清的有无、贮存容器中精液与空气比率对精子活力无显著影响。本实验在种鸡场内进行，一般是早上在喂食前采精，以防精液混有粪便，若要研究保存10 h 后的人工授精效果，则需要在晚上输精，不符合实际生产方面的需求，因此本研究只设置0、4、8、24 h 共4 个时间点。本研究所采用的稀释液可以在4℃保存24 h 而维持精子活力在0.5 以上，但其精子活力、受精率、出苗率和健雏率均显著降低，因此在稀释配方优化及长效保存方面仍需进一步研究。

4 结 论

本实验结果显示，我国南方地区夏季鸡稀释精液4℃保存优于37℃保存；4℃保存0～8 h 对精子活力、种蛋受精率、出苗率和健雏率没有显著影响；稀释液中添加0.5 μmol/L 褪黑素对精子活力、种蛋受精率、出苗率和健雏率均无影响。综合来看，以1:2 比例进行精液稀释4℃保存可获得较好的精液保存和人工授精效果。