白蒺藜皂苷对2型糖尿病大鼠视网膜的保护作用及TrkB信号通路的影响

赵艳霞，王 锋，王 爽

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，常伴随着高血糖、高脂血症、炎症，导致循环系统病理变化，进而诱导脑、心脏、神经、肾和视网膜血管损伤[1-3]。视网膜病变是糖尿病最常见的并发症，也是成人失明的主要原因，其特征在于黄斑水肿、视网膜缺血和异常新血管形成。糖尿病视网膜病变的早期迹象发现于前驱糖尿病患者，糖尿病视网膜病变可能与脑缺血、皮质萎缩和认知功能下降有关[4]。肌球蛋白受体激酶B(tropomyosin receptor kinase B， TrkB)途径可能在视网膜和其他神经组织中具有保护作用，其激活后，神经营养素-4(NT-4)出现局部增加，脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor， BDNF)水平升高，2种配体对TrkB受体具有高亲和力[5-6]。白蒺藜皂苷具有水溶性，具有类固醇或三萜糖苷配基结构，具有一个或多个水溶性碳水化合物的侧链。药理学研究表明，白蒺藜皂苷具有抗癌、抗氧化、降血糖的功效[7]。在动物模型中，白蒺藜皂苷可增强轴突再生并减少周围神经横断后的神经元死亡，提高学习和记忆任务，并促进中枢神经系统的神经发生[8]。本研究拟探讨白蒺藜皂苷对2型糖尿病大鼠视网膜的保护作用及TrkB信号通路的影响，为2型糖尿病视网膜病变的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 白蒺藜皂苷、链脲佐菌素(美国Sigma公司，批号L0209、L0317)；二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，批号190203)；伊凡斯兰、BCA蛋白浓度测定试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司，批号190122、181229)；FITC膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒、RIPA裂解缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司，批号AW58741、A0715)；TRIzol试剂、poly-A聚合酶(美国Invitrogen公司，批号SI6017、SI0156)；PrimeScript miRNA RT-PCR试剂盒、M-MLV逆转录酶(宝生物工程大连有限公司，批号M3317、M4219)；聚偏二氟乙烯膜、β-actin抗体(上海百研生物科技有限公司，批号SH30396、SH20149)；BDNF、p-TrkB抗体(美国Epitomics公司，批号V900400、V900407)；山羊抗兔辣根过氧化物酶二抗(美国Abcam公司，批号ab70544)；ECL Detection Reagent化学发光超敏显色试剂盒(美国Millipore公司，批号ST40074)。HGM-114血糖仪(欧姆龙健康医疗有限公司)；Lenstar-587新型眼球生物测量仪(美国赛默飞世尔科技公司)；CX43显微镜(日本奥林巴斯公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；Applied Biosystems 7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司)；LAS-4000图像分析仪(美国通用公司)。

1.2实验动物及分组 清洁级SD(Sprague Dawley)大鼠100只，8周龄，体重210～240 g，由吉林大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(吉)2018-0001，动物使用许可证号：SYXK(吉)2018-0003，动物质量合格证号：00341527。所有大鼠无视网膜病变，无眼底异常，随机分成对照组、模型组、二甲双胍组(20 mg/kg)、白蒺藜皂苷低剂量组(20 mg/kg)、白蒺藜皂苷高剂量组(40 mg/kg)，每组20只。

1.3模型制备 模型组、二甲双胍组、白蒺藜皂苷低、高剂量组腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素(溶于0.01 mol/L柠檬酸盐，pH值为4.4)诱导糖尿病，对照组大鼠注射等体积的生理盐水，48 h后检测大鼠尾静脉血血糖，血糖浓度≥16.7 mmol/L说明糖尿病模型建立成功[9]。同时检测视网膜，如果F-ERG波和Ops波的潜伏期延长且振幅减小，则认为2型糖尿病视网膜病变模型建立成功[9]。建模成功后，二甲双胍组、白蒺藜皂苷低、高剂量组给予相应药物腹腔灌胃，灌胃体积10 ml/kg，对照组和模型组给予10 ml/kg的生理盐水，每天1次，持续12周。

1.4大鼠血糖以及伊凡斯兰渗透量的测定 实验结束后，禁食12 h，尾静脉采血检测血糖。将30 g/L伊凡斯兰于尾静脉快速注入，2 h后，麻醉大鼠，摘除眼球，分离视网膜，37℃烘干，甲酰胺65℃孵育15 h，离心取上清液于628 nm处用分光光度计测量吸光度(A)值之差。

1.5大鼠视网膜病理切片制作及观察 常规脱水、包埋、切片后，二甲苯(Ⅰ)15 min、二甲苯(Ⅱ)15 min、二甲苯∶无水乙醇=1∶1 2 min、100%乙醇(Ⅰ)5 min、100%乙醇(Ⅱ)5 min、80%乙醇5 min、蒸馏水5 min、苏木精染色5 min、水洗10 min或流水冲洗5 min、1%盐酸乙醇30 s、水洗30 s、蒸馏水过洗5 s、0.5%伊红染色1～3 min、蒸馏水稍洗30 s、80%乙醇稍洗30 s、95%乙醇(Ⅰ)1 min、95%乙醇(Ⅱ)1 min、无水乙醇(Ⅰ)3 min、无水乙醇(Ⅱ)3 min、二甲苯(Ⅰ)3 min、二甲苯(Ⅱ)3 min、中性树胶封固。显微镜下观察大鼠视网膜结构变化。

1.6大鼠视网膜细胞凋亡水平检测 视网膜石蜡切片脱蜡，温和胰蛋白酶消化后，FACSCalibur流式细胞仪以及FITC膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒检测大鼠视网膜细胞凋亡水平。

1.7大鼠视网膜BDNF、p-TrkB mRNA水平检测 根据制造商的说明书，使用TRIzol试剂提取总RNA，使用PrimeScript miRNA RT-PCR试剂盒根据制造商的说明书进行RT-PCR反应。在具有oligo-dT衔接子的poly-A聚合酶存在下逆转录总RNA(500 ng)。用M-MLV逆转录酶将500 ng总RNA逆转录成cDNA的第一链。引物由生工生物工程上海股份有限公司合成。使用的引物序列如下：BDNF正向5'-TGAGAAGCACGACCTTCATGT-3'，反向5'-GGAACCCCTATGACCTCTTCA-3'；p-TrkB正向5'-GGTTGAGTGACCTTGGTGA-3'，反向5'-AAGTGGACCTATGACCCCTCTA-3'；β-actin正向5'-CCCAGATCATGTTTGAGACCT-3'，反向5'-GAGTCCATCACGATGCCAGT-3'。使用Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行qRT-PCR，β-actin用作内部对照，使用2-ΔΔCt方法计算BDNF、p-TrkB表达的相对定量。所有实验重复3次。

1.8大鼠视网膜BDNF、p-TrkB蛋白水平检测 使用1%RIPA裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白(50 mg)，然后转移至聚偏二氟乙烯膜。将膜用5%牛奶在室温下封闭2 h，然后在4℃下与BDNF、p-TrkB、β-actin一抗孵育过夜。将膜在含有吐温-20的磷酸盐缓冲液中洗涤3次，并与山羊抗兔辣根过氧化物酶二抗在室温下孵育2 h。使用ECL Detection Reagent化学发光超敏显色试剂盒使蛋白可视化，并使用LAS-4000图像分析仪检测信号，将数据标准化为β-actin。

2 结果

2.1血糖以及视网膜组织伊凡斯兰渗透量 与对照组比较，模型组血糖、伊凡斯兰渗透量水平升高(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组、白蒺藜皂苷低剂量组、白蒺藜皂苷高剂量组血糖、伊凡斯兰渗透量水平降低(P<0.01)；与二甲双胍组比较，白蒺藜皂苷低、高剂量组血糖、伊凡斯兰渗透量升高，但白蒺藜皂苷高剂量组低于白蒺藜皂苷低剂量组(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 5组大鼠血糖和视网膜组织伊凡斯兰渗透量比较

2.2视网膜结构情况 对照组大鼠视网膜结构正常；模型组视网膜各层细胞排列紊乱，血管内皮细胞增生、外核层细胞脱落、有炎性细胞浸润；二甲双胍组视网膜结构趋于正常，血管内皮细胞增生明显减少；白蒺藜皂苷低、高剂量组与模型组比较，细胞排列较正常，炎性细胞浸润减少。见图1。

图1 白蒺藜皂苷对大鼠视网膜结构的影响(HE×400)A.对照组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.白蒺藜皂苷低剂量组；E.白蒺藜皂苷高剂量组

2.3视网膜神经节细胞凋亡情况 对照组、模型组、二甲双胍组、白蒺藜皂苷低、高剂量组视网膜神经节细胞凋亡率分别为(1.54±0.59)%、(59.89±12.52)%、(15.96±5.85)%、(41.96±5.96)%、(28.85±3.55)%。与对照组比较，模型组视网膜神经节细胞凋亡水平升高(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组、白蒺藜皂苷低剂量组、白蒺藜皂苷高剂量组视网膜神经节细胞凋亡水平降低(P<0.05)；与二甲双胍组比较，白蒺藜皂苷低、高剂量组视网膜神经节细胞凋亡水平升高，但白蒺藜皂苷高剂量组低于白蒺藜皂苷低剂量组(P<0.05)。

2.4视网膜组织BDNF、p-TrkB mRNA水平 与对照组比较，模型组BDNF、p-TrkB mRNA水平降低(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组、白蒺藜皂苷低、高剂量组BDNF、p-TrkB mRNA水平升高(P<0.01)；与二甲双胍组比较，白蒺藜皂苷低、高剂量组BDNF、p-TrkB mRNA水平降低，但白蒺藜皂苷高剂量组高于白蒺藜皂苷低剂量组(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 白蒺藜皂苷对大鼠视网膜BDNF、p-TrkB mRNA水平的影响

2.5视网膜组织BDNF、p-TrkB蛋白水平 与对照组比较，模型组BDNF、p-TrkB蛋白水平降低(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组、白蒺藜皂苷低、高剂量组BDNF、p-TrkB蛋白水平升高(P<0.01)；与二甲双胍组比较，白蒺藜皂苷低、高剂量组BDNF、p-TrkB蛋白水平降低，但白蒺藜皂苷高剂量组高于白蒺藜皂苷低剂量组(P<0.05，P<0.01)。见表3、图2。

图2 白蒺藜皂苷对大鼠视网膜BDNF、p-TrkB蛋白水平的影响A.对照组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.白蒺藜皂苷低剂量组；E.白蒺藜皂苷高剂量组；BDNF为脑源性神经营养因子，TrkB为肌球蛋白受体激酶B

表3 白蒺藜皂苷对大鼠视网膜BDNF、p-TrkB蛋白水平的影响

3 讨论

白蒺藜皂苷具有平肝解郁、活血祛风、明目、止痒的功效，用于头痛眩晕、胸胁胀痛、乳闭乳痈等[10]。近期研究发现，白蒺藜皂苷具有滋养阴气，调节血液循环，驱散血瘀的作用[11]。

现代药理学研究证实，白蒺藜皂苷可抑制氧化应激，抑制细胞凋亡和衰老，改善微循环，促进组织修复和再生。一些初步研究证实，白蒺藜皂苷可有效修复受损的胰岛β细胞，降低糖尿病大鼠的血糖水平，对血管具有保护作用。在糖尿病患者中，白蒺藜皂苷可降低胰岛素抵抗，改善微血管功能障碍，并减少神经病变的症状。白蒺藜皂苷已被证明在多种视网膜疾病模型中具有保护作用，包括光诱导的视网膜变性、眼压损伤。白蒺藜皂苷可减轻视网膜神经细胞凋亡和凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达。本研究结果显示，与对照组比较，模型组血糖、视网膜组织伊凡斯兰渗透量、神经节细胞凋亡率升高；与模型组比较，二甲双胍组、白蒺藜皂苷低、高剂量组血糖、视网膜组织伊凡斯兰渗透量、神经节细胞凋亡率降低，且白蒺藜皂苷高剂量组低于白蒺藜皂苷低剂量组。提示白蒺藜皂苷能降低2型糖尿病大鼠血糖水平，同时对视网膜具有保护作用。病理学结果显示，模型组视网膜各层细胞排列紊乱，血管内皮细胞增生、外核层细胞脱落、有炎性细胞浸润；二甲双胍组视网膜结构趋于正常，血管内皮细胞增生减少；白蒺藜皂苷低、高剂量组较模型组细胞排列较正常，炎性细胞浸润减少。提示白蒺藜皂苷能减轻2型糖尿病大鼠视网膜炎症反应。

TrkB在视网膜中广泛表达，已在内层和外层视网膜神经节细胞、光感受器外段，以及增生性玻璃体视网膜病变期间的Müller细胞发现TrkB表达[12]。此外，TrkB可抑制STZ糖尿病大鼠视网膜外植体中的神经元凋亡，NT-4和BDNF均可在视神经横断中保护视网膜神经节细胞[13-14]。许多研究指出，TrkB信号转导途径及其配体作为视网膜保护的介质。通过ANA-12(特异性TrkB抑制剂)抑制TrkB途径，阻止配体BDNF与TrkB受体结合，阻止二甲双胍对视网膜变性的光诱导和遗传模型的保护作用[15-16]。关于运动对糖尿病视网膜保护的研究显示，糖尿病诱导视网膜变性后接受平板运动的小鼠在视网膜、海马和血清中表现出更高水平的BDNF、TrkB。在跑步机运动的糖尿病大鼠视网膜中也有高水平的BDNF、TrkB表达[17-18]。这些研究表明TrkB和BDNF表达水平都可以通过运动上调。本研究结果显示，与对照组比较，模型组BDNF、p-TrkB mRNA和蛋白水平降低；与模型组比较，二甲双胍组、白蒺藜皂苷低、高剂量组BDNF、p-TrkB mRNA和蛋白水平升高，且白蒺藜皂苷高剂量组高于白蒺藜皂苷低剂量组。与上述研究结果一致，提示白蒺藜皂苷能促进2型糖尿病大鼠视网膜BDNF、p-TrkB mRNA和蛋白高表达，进而激活TrkB信号通路。

综上所述，白蒺藜皂苷能降低2型糖尿病大鼠血糖水平，对视网膜有保护作用，其机制与白蒺藜皂苷能促进2型糖尿病大鼠视网膜BDNF、p-TrkB mRNA和蛋白高表达，进而激活TrkB信号通路相关。