胸腺肽α1对哮喘大鼠Th2/Th1平衡的调节及相关机制的研究

焦雨梅，褚鑫，许珂玉

(1.锦州医科大学医疗学院；2.锦州医科大学附属第一医院；3.锦州医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,辽宁 锦州 121000)

支气管哮喘是以嗜酸性细胞浸润为主，T淋巴细胞、肥大细胞、气道上皮细胞及多种细胞因子参与的Ⅱ型变态反应性疾病，具有气道高反应性及气道重塑等病理特征。目前研究发现支气管哮喘的发生是由于过敏原引起的变态反应促进CD4+细胞向Th2细胞过度分化，引起Th2因子如：IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等大量分泌，进而导致Th2/Th1失衡[1]。Florence Roan等人研究发现，来自上皮细胞分泌的细胞因子如：胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-33和IL-25等是Ⅱ型变态反应免疫的中枢调节因子,被称为警报因子，能有效诱导和激活淋巴细胞，可能在触发整个过敏性炎症过程中发挥至关重要的作用[2]。最近的研究数据证明，支气管哮喘病人中Th2细胞亚群的IL-33和IL-25受体高表达[3]，进一步支持了这些中枢调节细胞因子在加重哮喘免疫过程中的重要作用。本研究旨在以IL-25为研究靶点，探讨免疫调节剂胸腺肽α1对IL-25水平的影响及相关机制，为临床哮喘治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验动物

成年雄性Wistar大鼠50只，体重(200±20)g，由锦州医科大学动物实验中心提供，SPF级实验室饲养。

1.1.2 药物及试剂 卵清蛋白购自美国Sigma公司，百日咳杆菌、胸腺肽α1、和丙烯酰胺购自北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司，兔抗鼠NF-κB和抗β肌动蛋白(β-actin)抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG二抗，蛋白质定量试剂盒，DAB二氨基联苯显色试剂盒均购自SantaCruze，Trizol购自Invitrogen，十二烷基苯磺酸钠(SDS)GenView分装。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型的建立

(1)哮喘模型建立：大鼠分别于第1天和第8天2次致敏，腹腔注射致敏液(含有OVA100 mg，百日咳杆菌5×109，氢氧化铝200 mg溶于1 mL的生理盐水中)，1 w后开始用1%OVA雾化进行致敏和激发大鼠，每次持续30 min，连续6 w，正常组用生理盐水代替OVA；(2)分组及给药：将大鼠随机分为5组：正常组为阴性对照组、哮喘模型组为阳性对照组、地塞米松治疗组、胸腺肽治疗组和地塞米松与胸腺肽联合治疗组。除正常组外，每只大鼠每次OVA雾化前30 min腹腔注射给药，哮喘组注射1 mL生理盐水，地塞米松组按0.5 mg/kg注射地塞米松，胸腺肽治疗组按0.5 mg/kg注射胸腺肽，联合治疗组按0.25 mg/kg地塞米松和胸腺肽0.5 mg/kg分别注射。

1.2.2 肺通气功能检测

末次给药24 h后，测量每组大鼠的呼吸频率和潮气量，并计算每分钟通气量。

1.2.3 ELISA检测大鼠肺泡灌洗液(BALF)及血清IL-25及IL-5水平测定

末次给药24 h后取大鼠外周血2 mL，离心后取血清待测，然后2%戊巴比妥钠，以40 mg/kg腹腔注射麻醉，无菌操作开胸暴露气管，进行插管，无菌注射器注入5 mL生理盐水，灌洗3次，回收的灌洗液3 mL，4 ℃，1500 r离心10 min，回收上清置于-20 ℃等待进行细胞因子检测。按照ELISA试剂盒严格操作，分别检测血清IL-25及IL-5的含量。

1.2.4 Western blot 测定各组大鼠NF-κB的表达

取大鼠肺组织，加入细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH为7.5，1 mmol/L EDTA，0.15 mmol/L NaCl，0.5%Triton X-100)制备组织匀浆，4 ℃离心12 000 rpm，15 min，分离上清提取总蛋白，Bradford法测上清液的蛋白含量，以β-actin的表达水平作为等量蛋白质上样对照，取60 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用封膜液(5%脱脂奶，含0.05%的TWeen20磷酸缓冲液)室温封闭30 min，漂洗3次，每次10 min，加入β-actin和兔抗鼠的NF-κB多克隆抗体1∶1000稀释，4 ℃孵育过夜，再次漂洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗1∶5000稀释，37 ℃摇床室育2 h，再次漂洗3次，DAB显影，凝胶图像分析系统系统对目的蛋白表达进行分析。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 肺通气功能检测

见表1。

表1 各组大鼠的肺通气功能比较

2.2 血清及肺泡灌洗液IL-25及IL-5的水平

见表2、表3。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液IL-25、IL-5的浓度的比较

表3 各组大鼠血清IL-25、IL-5的浓度比较

2.3 各组肺组织NF-κB的表达水平

Western bloting测定各组大鼠NF-κB的表达，以β-actin做对照进行定量测定，见表4，见图1。

注：A正常组；B哮喘组；C地塞米松治疗组；D胸腺肽组；E联合用药组；β-actin为细胞蛋白表达水平内参对照

表4 各组大鼠NF-κB的表达水平比较

2.4 NF-κB的表达与IL-25的浓度的相关性

见表5。

表5 NF-κB的表达与IL-25表达水平的相关性

3 讨 论

支气管哮喘是一种以可逆性气流受限、气道炎症和气道高反应为特征的慢性气道疾病，而Ⅱ型免疫反应(包括Ⅱ型辅助T细胞、Ⅱ型固有淋巴细胞、嗜酸粒细胞等细胞的反应)在哮喘的发生发展中具有重要作用，关于哮喘发生的免疫学机制目前认为变态反应引起的Th1/Th2失衡是其发病的主要原因。Florence Roan等人研究认为，IL-25作为IL-17细胞因子家族的一员，其受体包含IL-17RA(信号亚单位)和IL-17RB(特异性分子结合亚单位)两个亚单位，能够通过多种机制直接活化嗜酸粒细胞(eosinophil，EOS)，导致EOS浸润引起哮喘发生[2-3]462-469，639-648。Du W等人也有类似研究，发现哮喘患者成熟EOS表面IL-17RA和IL-17RB表达水平以及血浆IL-25水平均比非哮喘人群显著升高，而在吸入过敏原激发后，哮喘患者血浆和EOS胞内IL-25水平、EOS表面IL-17RA/RB及IL-17RB受体水平均显著升高。在OVA致敏和激发小鼠中，敲除IL-25显著减轻了OVA诱导的气道EOS细胞浸润，肺泡灌洗液中EOS和肺组织中新生的EOS均明显减少，说明了IL-25在哮喘发生病理过程中起了至关重要的作用[4-5]。

胸腺肽α1是由28个氨基酸组成的短肽，是临床常用的免疫调节剂，具有调节和增强人体细胞免疫功能的作用。目前关于胸腺肽治疗支气管哮喘鲜有报道，本文旨在探讨胸腺肽α1对IL-25及Th2因子IL-5水平的影响及可能的相关机制。研究结果显示哮喘组BALF和血清中的IL-25及IL-5水平均高于正常组，且具有差异显著(P<0.01)，与哮喘组比较，经地塞米松、胸腺肽α1及联合治疗后IL-25及IL-5表达水平均显著下降(P<0.01)，且联合用药效果与地塞米松没有显著性差异，推测胸腺肽α1治疗哮喘可能通过降低IL-25与IL-5表达水平而实现的。

NF-κB是广泛存在于细胞胞浆的多效能的转录因子，正常情况下NF-κB与其抑制物结合，抑制其转录活性。NF-κB可受氧化应激、细胞因子或前炎症因子等多种刺激而活化，通过与多种基因启动子部位的κB位点的特异结合促进基因表达。本研究为了进一步探索可能发生的机制[6]，实验中利用Western blot检测实验各组中NF-κB的表达水平，结果显示，哮喘组NF-κB的表达水平明显高于正常对照组，胸腺肽α1治疗组、地塞米松组和联合用药组与哮喘组比较表达水平均明显下降(P<0.01)，联合用药组与地塞米松治疗组比较差异不显著，没有统计学意义，为了进一步了解他们之间相关性，进行了统计学线性相关性分析，结果显示肺泡灌洗液和血清中IL-25与IL-5表达水平，二者高度正相关(r=0.97，r=0.93，P<0.01)，推测IL-5的表达可能依赖IL-25表达，哮喘变态反应IL-25作为中枢调节因子与受体结合后促进Th2细胞分化，进而促进IL-5表达的结果，为了进一步分析IL-25与NF-κB表达水平的相关性，分别对其表达结果做相关性分析，结果显示IL-25与NF-κB表达水平成高度正相关(r=0.96，P<0.01)，推测IL-25表达水平均与NF-κB的表达密切相关，是否通过IL-25与其受体结合激活NF-κB进而促进IL-5的表达有待于进一步深入研究。

临床上哮喘患者通常反复发作，应用糖皮质激素治疗哮喘会常常会带来很多副作用，如骨质疏松、股骨头坏死、血糖增高等，能探索取代或减少激素用量的有效药物，对临床治疗有重要意义。

从本实验研究结果显示，胸腺肽α1与地塞米松联合用药可减少地塞米松的用量，且治疗效果与单纯应用地塞米松没有显著差异，可作为临床治疗哮喘的辅助免疫调节剂，为临床哮喘的治疗提供了实验性依据和参考价值。