糖皮质激素诱导转录因子1基因中rs37973位点基因型对哮喘发病的影响

肖虹 朱卫华 刘恺丰 王庆义

近年来，哮喘的发病率和死亡率明显升高，其发病涉及遗传、吸烟、环境污染等多种因素。有研究发现，哮喘患者存在明显的家族聚集倾向，遗传度达到60.0%～80.0%[1]，这为研究哮喘的发病机制和分子遗传学诊断提供了重要思路。近年来，全基因组关联分析(GWAS)的迅猛发展为基因研究提供了全新手段，与传统候选基因相联分析比较具有一定优势。药物基因组学研究发现，糖皮质激素诱导转录因子1(GLGGI1)基因可明显降低糖皮质激素治疗的反应性[2]，且rs37973位点突变起重要作用，其多态性可有效预测糖皮质激素治疗效果。本研究对哮喘患者GLGGI1基因rs37973位点多态性与哮喘发病的相关性进行分析，为哮喘的早期预防、诊断及治疗提供指导。

对象与方法

1.对象：2017年6月～2018年10月郑州颐和医院收治的哮喘患者332例(观察组)，所有患者均符合2016年版《支气管哮喘防治指南》[3]关于哮喘的诊断标准。纳入标准：(1)近4周未使用全身糖皮质激素或白三烯调节剂治疗；(2)近4周内无感染性疾病，无合并严重的心脑血管、肝脏、肾、肺等实质性脏器疾病，无过敏性鼻炎、皮炎等疾病。选取同期于我院体检的240例健康者作为对照组。其中观察组男195例，女137例，年龄18～65岁，平均年龄(38.27±8.39)岁，病程0.6～10.3年，平均病程(4.54±2.14)年，轻度哮喘74例、中度哮喘193例、重度哮喘61例；对照组男137例，女103例，年龄19～69岁，平均年龄(37.95±9.41)岁。两组受试者性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经郑州颐和医院伦理委员会审核批准。

2.方法

(1)GLGGI1基因检测：抽取两组受试者外周静脉血5 ml，置于抗凝管中并加入乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)抗凝处理，经3 000 r/min离心10 min，随后吸取出白细胞层，采用改良碘化钠法提取基因组DNA待测。聚合酶链反应(PCR)引物序列：上游：5’-CGAAGATGCAGCGAGCTACG-3’；下游：5’-GGTACGAGCTAGGAGCAAGT-3’，引物购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，扩增长度为526 bp。PCR反应系统包括10×Buffer缓冲液(25 μl)、2.5 mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTP)混合物(10 μl)、基因组DNA(1 μl)、上游和下游引物(各1 μl)、Tap DNA聚合酶(1.25 U)，共50 μl。PCR反应过程按照说明书进行。取6 μl含载样缓冲液PCR扩增产物，加入含溴化乙锭2%琼脂糖凝胶行电泳实验。采用3730测序仪对PCR扩增产物进行双向测序反应，同时采用BLAST软件分析，将测序结果与数据库中已登录序列进行同源性分析。检测指标包括GLGGI1基因rs37973位点基因型AA、AG、GG比例和T、C基因频率。

(2)肺功能检测：根据病情按需吸入糖皮质激素(ICS)后，采用日本美能AS-507肺功能检查仪对观察组患者的肺功能进行检测，包括第1秒用力呼气容积(FEV1)、FEV1/用力肺活量(FVC)，重复进行3次，取其中患者配合、肺功能图像和数据最佳的1次作为最终结果。

(3)外周血嗜酸性粒细胞(EOS)百分比检测：抽取观察组患者外周静脉血5 ml，经3 000 r/min离心10 min，分离血清，于-70 ℃低温保存。采用SysmexXS-1800i型全自动血液分析仪及其原装配套试剂检测EOS百分比。

结 果

1.对照组和观察组受试者GLGGI1基因rs37973位点基因型和等位基因频率比较：观察组AG基因型患者比例和G等位基因频率明显高于对照组，AA基因型患者比例和A等位基因频率明显低于对照组(P<0.05)，两组GG基因型患者比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 对照组和观察组受试者GLGGI1基因rs37973位点基因型和等位基因频率比较[例，(%)]

2.不同基因型哮喘患者肺功能及外周血EOS百分比比较：AG组患者FEV1和FEV1/FVC均明显低于AA组和GG组，外周血EOS百分比明显高于AA组和GG组(P<0.05)，而AA组和GG组患者FEV1、FEV1/FVC及外周血EOS百分比比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同基因型哮喘患者肺功能及外周血EOS百分比比较

3.GLGGI1基因rs37973位点基因型对哮喘发病的相对危险度分析：单变量logistic回归分析结果显示，GLGGI1基因rs37973位点AG基因型和AG+GG均是哮喘发病的相对危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 GLGGI1基因rs37973位点基因型对哮喘发病的相对危险度分析[例，(%)]

讨 论

ICS治疗是目前哮喘治疗指南推荐的方案，能明显改善患者症状，减少哮喘急性发作次数，改善其肺功能[4]。但在临床实际治疗过程中发现，部分患者即使规范ICS，其病情仍迁延难愈，重者可出现肺功能恶化、EOS计数增多及激素抵抗现象，被称为激素抵抗型(SR)哮喘[5]。SR哮喘患者虽所占比例不高，仅约5.0%左右，但其治疗难度高、疗效差，对患者的危害极大。有研究发现，某些基因变异体与哮喘疗效密切相关[6]，提示基因多态性可能影响哮喘治疗的有效性，通过基因测定进而选取个性化哮喘治疗方案，为哮喘治疗提供了全新的思路。药物遗传学研究结果显示，对接受ICS治疗的哮喘患者，定位基因和单核苷酸序列，并分析其与肺功能、哮喘急性发作次数等指标的相关性，可为哮喘治疗提供基因层面靶点[7]。

GLGGI1是糖皮质激素发挥疗效途径中的重要候选基因，其位于7p21.3，基因中含有8个外显子。国外已有关于GLGGI1基因与哮喘ICS治疗疗效相关性的报道[8]。Tantisira等[9]的研究结果发现，单核苷酸多态性(SNP)rs37973与哮喘患者ICS反应时的肺功能呈线性相关，其定位于GLGGI1基因，且二者显现出完全连锁不平衡关系，该位点多态性能有效预测患者ICS治疗的反应性。一项对白种人的研究发现，GLGGI1基因rs37973位点主要等位基因为A，次要等位基因为G，其中G基因频率为44.0%，携带rs37973位点次要等位基因能增加ICS抵抗，且在排除其他因素影响后，携带纯合子主要等位基因哮喘患者的肺功能改善率明显高于纯合子次要等位基因患者[10]。相关文献报道，GLGGI1基因表达升高可能为细胞凋亡的早期信号，而ICS作用机制为抑制多种炎症细胞、细胞因子释放及活化，其中促进凋亡是其重要作用机制，而变异型的出现可能抑制GLGGI1基因表达，减少炎症细胞凋亡数量，最终引起ICS抵抗。本研究结果显示，观察组GLGGI1基因rs37973位点AG基因型患者比例明显高于对照组，次要等位基因G频率明显高于对照组，同时比较ICS对不同基因型哮喘患的疗效发现，AG组患者FEV1和FEV1/FVC均明显低于AA组和GG组，EOS百分比数明显高于AA组和GG组，提示次要等位基因G可能增加哮喘的发生风险[11]，同时AG和GG基因型可能增加ICS抵抗。了解GLGGI1基因rs37973位点多态性能预测哮喘对ICS的反应性，原因可能为AG和GG基因型可抑制GLGGI1基因表达，使GLGGI1介导的炎症细胞凋亡作用减弱，进而降低ICS改善肺功能的效应[12]。单变量logistic回归分析结果显示，AG基因型和AG+GG均是哮喘发病的相对危险因素，证实GLGGI1基因rs37973位点中G等位基因可能增加哮喘的发病风险。但本研究样本量偏小，结论可能存在一定偏倚，需后续增加样本量深入研究。

综上所述，哮喘患者GLGGI1基因rs37973位点存在基因多态性，且其多态性与哮喘的发病密切相关，rs37973位点等位基因A向G突变可增加哮喘的发病风险，同时AG基因型哮喘患者的肺功能较AA和GG基因型差，对于此类患者，更应注重监测肺功能。