佛手和甜橙果汁及挥发油对油酸致兔耳痤疮的预防作用

邱稼飞 王 璇 张南海 赵 亮,2 张列兵 吴 薇 籍保平 周 峰*

(1.中国农业大学 食品科学与营养工程学院/植物源功能食品北京市重点实验室，北京 100083；2.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；3.中国农业大学 工学院，北京 100083)

痤疮是一种慢性毛囊皮脂腺疾病，主要由于毛囊皮脂腺角化速度加快，诱发粉刺形成，造成毛囊内的无氧环境，引起痤疮丙酸杆菌增殖，从而诱导或加重痤疮病变，其中亚油酸含量不足、皮脂中脂质过氧化、雄激素分泌过多、外部油脂类产品刺激等都会引起皮肤毛囊皮脂腺角化[1]。目前痤疮的治疗方法一般为药物治疗和物理治疗，我国中医还采取内服、外治、针灸法预防及治疗痤疮[2]。由于长期服用药物会产生一定副作用，因此，研究并挖掘具有改善痤疮作用的物质，特别是天然产物成为研究热点。

佛手(CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle)为芸香科柑橘属植物，是一种药食同源的植物，富含维生素C、佛手多糖、香豆素、橙皮苷、柠檬素油等化合物。甜橙(Citrussinensis(L.)Osbeck)为芸香科柑橘属植物，含有丰富的β-胡萝卜素、维生素C、多酚类、黄酮类、生物碱等物质，具有较高的营养价值和较强的抗氧化作用。果汁和挥发油是它们最常见的两种产品形式，国外报道佛手精油具有抗菌活性[3]，佛手汁具有降血脂、抗氧化、抗炎症等作用[4]，还有报道称柑橘精油有抗菌、抗氧化作用[5]。因此，目前研究佛手、甜橙的果汁和挥发油对食物改善痤疮具有重要意义。

本研究拟采用兔耳内侧涂抹油酸建立痤疮模型[6]，研究佛手和甜橙的果汁及挥发油对兔耳痤疮模型中兔耳组织病理学、皮脂分泌量、氧化应激指标和炎症因子的影响，以期为开发无毒副作用且能改善痤疮的佛手、甜橙产品提供理论依据，促进2种植物原料向精深加工发展，提高其产物利用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料及试剂

SPF级雄性健康新西兰兔66只，2.5±0.1 kg，购买并饲养于北京芳元缘实验动物中心，SCXK(京)2014-0012。

佛手购于浙江金华，甜橙购于广东江门；复方珍珠暗疮胶囊，陕西东泰制药有限公司。

甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)、总抗氧化能力(T-AOC)、还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、维生素E(VE)、丙二醛(MDA)试剂盒，南京建成生物工程研究所；白三烯B4(LTB4)、白介素-1α(IL-1α)、白介素-6(IL-6)试剂盒，北京科盈美科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器及设备

AY220 精密分析天平(0.000 1 g)，日本岛津公司；SpectraMax M2e酶标仪，美国Molecular 公司；HV-200型压榨机，东兴仪器有限公司；超低温冰箱，中科美菱低温科技有限责任公司；超声波细胞破碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；RE-2000旋转蒸发仪、SHZ-III循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1佛手汁制备

将佛手鲜果切成1 cm×1 cm×1 cm的小块，压榨取汁后置于冰箱中冷藏过夜，过滤得到佛手汁。

1.3.2佛手挥发油制备

参照《中华人民共和国药典》挥发油测定方法[7]。将佛手果皮切成8 mm×8 mm×1 mm小块，取一定量于圆底烧瓶中，加入4倍体积蒸馏水，采用水蒸气蒸馏法提取2 h，收集挥发油并加无水硫酸钠脱水，最后过滤去掉硫酸钠即得到佛手挥发油。

1.3.3甜橙汁制备

将甜橙切成4 cm×4 cm×4 cm的小块，压榨取汁后置于冰箱中冷藏过夜，过滤得到甜橙汁。

1.3.4甜橙挥发油制备

将甜橙果皮切成8 mm×8 mm×8 mm小块，取一定量于圆底烧瓶中，加入6倍体积蒸馏水，采用水蒸气蒸馏法提取6 h，收集挥发油并加入无水硫酸钠脱水，最后过滤去掉硫酸钠即得到甜橙挥发油。

1.3.5动物分组及处理

新西兰兔适应性饲养1周，饲喂正常维持饲料，自由采食、饮水。66只雄性新西兰兔适应性饲养结束后随机分为11组，分别为空白组、模型组、阳性药物组、甜橙汁低剂量组、甜橙汁高剂量组、甜橙挥发油低剂量组、甜橙挥发油高剂量组、佛手汁低剂量组、佛手汁高剂量组、佛手挥发油低剂量组、佛手挥发油高剂量组。采用每天固定时间灌胃给药，空白组、模型组灌胃10 mL/kg生理盐水，阳性药物组按照人每日服用换算，新西兰兔每日需服阳性药物1.65粒，按照体积比1∶6加入蒸馏水中配制成水溶液，灌胃4 mL/kg复方珍珠暗疮胶囊，佛手汁低高剂量组分别灌胃8.4、10.5 mL/kg，佛手挥发油低高剂量组分别灌胃0.125、0.2 mL/kg，甜橙汁低高剂量组分别灌胃8.4、10.5 mL/kg，甜橙挥发油低高剂量组分别灌胃0.125、0.2 mL/kg，试验周期为3周，除空白组，其余组第2周开始用体积分数为50%的油酸石蜡溶液涂抹于兔耳内侧耳管开口处，每天1次，每次0.5 mL，直至试验结束。

试验结束前禁食12 h(自由饮水)，用乙醚使新西兰兔深度昏迷，兔耳静脉注射空气处死。剪取兔耳痤疮受损处，一部分用于组织学观察，另一部分经液氮速冻后储存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3.6兔耳组织病理学指标测定

肉眼及光镜下观察兔耳痤疮模型兔耳受损部位组织学变化，根据毛囊扩张和炎细胞浸润程度对兔耳组织病理学进行分级。(-)：毛囊扩张、炎细胞浸润程度与正常组织相同；(+)：毛囊轻度扩张、局灶性炎细胞浸润；(++)：毛囊中度扩张、局灶性炎细胞浸润并出现多个浸润灶；(+++)：毛囊高度扩张、炎细胞弥漫性浸润。

1.3.7兔耳组织生化指标检测

称取兔耳组织0.5 g，破碎成小块，按质量体积比(m(兔耳组织)∶V(盐水))=1∶9 g/ mL的比例加入生理盐水制成匀浆，置于冷冻离心机中3 000 r/min离心10 min取上清液，按试剂盒要求检测兔耳组织中TG、FFA、LTB4、IL-1α、IL-6、T-AOC、GSH、SOD、VE、MDA含量。

1.4 统计学处理

试验结果以均值±标准偏差(Mean±SD)表示，采用SPSS 18.0软件单因素方差分析ANOVA (one-way analysis of variance)和多重比较检验分析Duncan’s分析不同组数据间显著性，P<0.05表示数据间具有显著差异，采用GraphPad Prism 8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 兔耳组织病理学观察

与空白组相比，油酸可使兔耳厚度增加，皮肤粗糙，毛囊口扩张并隆起，并出现一定量的丘疹和脓包，且出现弥漫性炎细胞浸润(图1)，表明痤疮模型构建成功。各干预组兔耳痤疮较模型组症状有较明显的改善，脓包较少出现，毛囊隆起较少，炎细胞浸润减少，说明阳性药物、甜橙汁、甜橙挥发油、佛手汁、佛手挥发油对痤疮均有一定的改善作用，其中甜橙挥发油剂量组对痤疮的改善作用最好，其次是佛手挥发油组，佛手汁和甜橙汁的效果较差，可能由于挥发油中改善痤疮症状的有效成分含量较高[8](表1)。

(a)空白组；(b)模型组；(c)阳性药物组；(d)甜橙汁低剂量组；(e)甜橙汁高剂量组；(f)甜橙挥发油低剂量组；(g)甜橙挥发油高剂量组；(h)佛手汁低剂量组；(i)佛手汁高剂量组；(j)佛手挥发油低剂量组；(k)佛手挥发油高剂量组。(a) Control group; (b) Model group; (c) Positive drug group; (d) Low dose sweet orange juice group; (e) High dose sweet orange juice group; (f) Low dose sweet orange volatile oil group; (g) High dose sweet orange volatile oil group; (h) Low dose bergamot juice group; (i) High dose bergamot juice group; (j) Low dose bergamot volatile oil group; (k) High dose bergamot volatile oil group.图1 不同处理组兔耳外观形态Fig.1 Appearance and morphological of rabbit ear in different treatment groups

表1 不同处理组兔耳组织病理学形态变化结果Table 1 Changes in pathological morphology of rabbit ear tissue in different treatment groups 只

表1(续) 只

2.2 不同处理下兔耳组织皮脂含量变化

毛囊皮脂中甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)含量增加，可引发角质形成细胞过度增殖，毛囊皮脂腺导管过度角化，导致微粉刺的形成，进而产生痤疮[9-10]。由图2可知，模型组兔耳组织TG、FFA含量较空白组显著增加(P<0.05)，而与模型组相比，各干预组能显著降低TG和FFA含量(P<0.05)，同时挥发油组效果优于果汁组，且随着剂量的增加TG和FFA含量降低。对于TG含量，甜橙和佛手挥发油高剂量组可使其基本恢复至正常水平，与阳性药物组一致，对于FFA含量，甜橙挥发油高剂量组、佛手挥发油低高剂量组效果最优，且佛手挥发油低高剂量组优于阳性药物组。表明各干预组可通过降低TG和FFA对毛囊皮脂腺的刺激，达到改善油酸诱导痤疮的效果。

A，空白组；B，模型组；C，阳性药物组；D，甜橙汁低剂量组；E，甜橙汁高剂量组；F，甜橙挥发油低剂量组；G，甜橙挥发油高剂量组；H，佛手汁低剂量组；I，佛手汁高剂量组；J，佛手挥发油低剂量组；K，佛手挥发油高剂量组。柱上不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。下图同。A, control group; B, model group; C, positive drug group; D, low dose sweet orange juice group; E, high dose sweet orange juice group; F, low dose sweet orange volatile oil group; G, high dose sweet orange volatile oil group; H, low dose bergamot juice group; I, high dose bergamot juice group; J, low dose bergamot volatile oil group; K, high dose bergamot volatile oil group. Columns marked with different letters represent significantly different (P<0.05) within groups. The same below.图2 不同处理组兔耳组织甘油三酯质量分数(a)和游离脂肪酸质量摩尔浓度(b)的变化Fig.2 Changes of triglyceride mass fraction (a) and free fatty acid molality (b) of rabbit ear tissue in different treatment groups

2.3 不同处理下兔耳组织LTB4含量变化

脂肪氧合酶的作用产物白三烯B4(LTB4)也能诱导角质形成细胞过度增殖，还能在没有痤疮丙酸杆菌的情况下诱导并加强炎症反应[11]，痤疮丙酸杆菌的作用是使角鲨烯分解或转化为过氧化角鲨烯[12]。张保恒[13]研究发现LTB4可能在寻常痤疮发病中起重要作用，参与痤疮的炎症过程。由图3可知，模型组LTB4含量是空白组的3倍左右(P<0.05)，各干预组较模型组能显著降低LTB4含量(P<0.05)，甜橙挥发油高剂量组对LTB4含量的降低作用最显著，且优于阳性药物组。这说明干预组能通过降低LTB4含量减轻痤疮的炎症反应。

图3 不同处理组兔耳组织白三烯B4质量分数的变化Fig.3 Changes of leukotriene B4 mass fraction of rabbit ear tissue in different treatment groups

2.4 不同处理下兔耳组织IL-1α和IL-6含量变化

皮脂分泌增多会使皮肤中角鲨烯含量增加，从而刺激毛囊皮脂腺过度增殖，导致白介素-1α(IL-1α)、白介素-6(IL-6)等炎症因子的释放[14-15]，进一步诱导毛囊漏斗部的角质化，加重毛囊皮脂腺导管的过度角化[14]。与空白组相比，模型组IL-1α和IL-6含量显著增加(P<0.05)(图4)，随着剂量的加大炎症因子含量减少，挥发油组均优于果汁组，甜橙和佛手挥发油高剂量组可显著降低IL-6含量(P<0.05)，其中甜橙挥发油高剂量组效果最佳，可能甜橙挥发油降低炎症作用更优。综上，挥发油各剂量组对痤疮炎症因子表达水平的抑制作用优于其他干预组，可能是由于挥发油中含有较高含量的抗炎活性物质[16]，可以通过抑制炎症反应而改善痤疮。

图4 不同处理组兔耳组织白介素-1α(a)和白介素-6(b)质量分数的变化Fig.4 Changes of interleukin-1α (a) and interleukin-6 (b) mass fraction of rabbit ear tissue in different treatment groups

2.5 不同处理下兔耳组织抗氧化能力变化

机体抗氧化能力反映了机体内酶促及非酶促体系总的自由基清除能力和过氧化物分解能力等[17]。研究表明，痤疮患者体内过氧化物含量明显增加[18]。Sarici等[19]研究表明，痤疮患者体内SOD含量显著低于正常水平；Pham等[20]研究也表明痤疮患者体内VE含量显著下降，可能与体内过氧化物含量增加有关。模型组T-AOC、GSH、SOD、VE水平较空白组显著降低(P<0.05)，其余各组均能提高这些指标水平，随着剂量的增大也逐渐增大，挥发油组优于果汁组，其中甜橙挥发油高剂量组作用效果最佳，且其SOD水平优于阳性药物组(图5)。可能由于挥发油能够更有效的保护和增强机体的抗氧化能力，减少痤疮患者体内过氧化反应的发生，且甜橙挥发油中抗氧化单体成分活性可能更高，因而抗氧化作用优于佛手挥发油。

(a)总抗氧化能力；(b)谷胱甘肽质量分数；(c)超氧化物歧化酶的活力；(d)维生素E质量分数。(a) Total antioxidant capacity; (b) Mass fraction of glutathione; (c) Activity of superoxide dismutase; (d) Mass fraction of vitamin E.图5 不同处理组兔耳组织抗氧化指标的变化Fig.5 Changes of antioxidant indexes of rabbit ear tissue in different treatment groups

2.6 不同处理下兔耳组织MDA含量变化

丙二醛(MDA)是脂质过氧化的终产物，其水平反映了机体脂质过氧化程度[21]，模型组MDA含量较空白组显著增加(P<0.05)，说明模型组兔耳组织中发生了脂质过氧化反应(图6)。与模型组相比，甜橙、佛手挥发油组和果汁高剂量组均能显著降低MDA含量(P<0.05)，并且随着剂量的增加MDA含量降低，挥发油对MDA含量的降低作用优于果汁组。说明痤疮患者体内会出现脂质过氧化，导致痤疮病症的不断发展，而挥发油具有良好的抗氧化作用，可能有效地抑制体内脂质过氧化的发生，抑制痤疮的不断发展。

图6 不同处理组兔耳组织丙二醛质量分数的变化Fig.6 Changes of malondialdehyde mass fraction of rabbit ear tissue in different treatment groups

3 结 论

本研究采用油酸致新西兰兔痤疮模型评价了不同剂量甜橙挥发油、甜橙汁、佛手挥发油、佛手汁对痤疮的干预作用。兔耳涂抹油酸2周后，兔耳皮肤粗糙且增厚，毛囊口隆起并出现一定量的红色丘疹和脓包，并伴随弥漫性炎细胞浸润，皮脂分泌量增加，炎症因子和MDA含量升高，抗氧化能力减弱，灌胃干预物质后均能不同程度地降低皮脂分泌量、炎症因子和MDA含量，增强抗氧化能力，从而达到改善痤疮症状，随着剂量的升高改善效果越好，且挥发油组普遍优于果汁组，其中甜橙挥发油组效果最佳，其次是佛手挥发油组，而甜橙汁和佛手汁作用效果较差，可能是由于挥发油中改善痤疮的有效成分的含量较高，甜橙挥发油中有效成分高于佛手挥发油。