羽衣甘蓝花青素的定位及含量成分测定

王玉书 赵 爽 张 琳 崔剑英 王紫薇 曲美卓玛 高岩松 辛喜凤

(1.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.河北省保定市农产品质量监督管理站，河北 保定 071000)

羽衣甘蓝(BrassicaoleraceaL. var.acephala; 2n=18)为十字花科芸薹属甘蓝种的变种。由于其多变的叶形和多彩的叶色，已经成为重要的园林绿化植物。作为蔬菜，其富含的维生素、矿物质及一些生物活性物质，又具有重要的营养价值[1]。

高等植物呈现出丰富多变的颜色取决于天然植物色素的存在，包括叶绿素(chlorophyll)、类黄酮(flavonoids)、类胡萝卜素(carotenoids)和甜菜色素(betalains)等，不同种类植物积累色素不同因而表现为不同的颜色。紫色、红色、粉色和玫红等叶色的羽衣甘蓝中含有丰富的花青素[2]。花青素作为类黄酮类化合物，广泛存在于植物的叶、花和果实等器官中。它既能赋予植物绚丽的颜色，又可以提高植物自身的光保护、抗旱、抗冻、抗病和抗氧化等能力[3-4]。除此之外，花青素具有抗炎、抗肿瘤、防衰老、降糖、降脂和预防心血管疾病等多重保健功效[5-8]。植物中最常见的花青素包括天竺葵素、矢车菊素、飞燕草素、芍药素、矮牵牛素和锦葵素6种色素，不同的花青素会呈现出不同的颜色。花青素通常以糖基化的形式存在，同时这些糖苷经常被芳香酸和脂肪酸酰基化，如香豆素、咖啡酸、阿魏酸、没食子酸、丙二酸和苹果酸等[9]。花青素成分及含量的差异直接影响植物各器官颜色的呈现，因此对花青素分布及成分含量研究具有重要意义。

目前，关于羽衣甘蓝花青素特性的研究鲜有报道。本研究利用徒手切片法制片在光学显微镜下观察花青素在羽衣甘蓝茎叶中的分布情况，测定紫叶羽衣甘蓝叶片中花青素含量，同时通过HPLC-MS技术鉴定紫叶羽衣甘蓝心叶中所含花青素的成分，旨在明确羽衣甘蓝植株体内花青素的分布、种类及含量情况，以期为羽衣甘蓝花青素的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取紫叶和白叶2个不同羽衣甘蓝纯系‘D07’和‘D06’(图1)，于2019 年盆栽种植于齐齐哈尔大学实验基地，长至莲座期后分别置于10 ℃/6 ℃和20 ℃/6 ℃(日温/夜温)生长15 d，于观赏期取样试验。

图1 紫叶(a)和白叶(b)羽衣甘蓝DH系Fig.1 The purple (a) and white (b) leaf pure lines of kale

1.2 切片制作

将新鲜的羽衣甘蓝叶片和茎段洗净并泡在蒸馏水中湿润备用，用双面刀片沿着植物材料切口平行切下，切下后将刀片上的植物组织轻轻转移至盛有蒸馏水的培养皿中，用镊子轻轻取出切面完整、薄厚均匀的组织制成临时装片。置于光学显微镜下观察、拍照。

1.3 花青素相对含量测定

花青素测定方法参考邝敏杰等[10]的方法。取 2 g 新鲜叶片，加入30 mL提取液(0.1 mol/L HCl和95%乙醇体积比为l∶1)，60 ℃水浴1 h，浸提1次，4 ℃，5 000 r/min离心15 min，过滤。取花青素提取液1 mL，分别加入2 mL、pH 1.0的KCl缓冲液和pH 4.5的乙酸钠缓冲液，振荡摇匀，于520 和700 nm下测吸光值，重复3次。总花青素含量计算公式如下:

式中：C，花青素含量，mg/g；A，pH 1.0和pH 4.5缓冲液光密度值的差值；V，提取液总体积，mL；n，稀释倍数；M，矢车菊-3-葡糖苷的相对分子质量，449.2；ε，矢车菊-3-葡糖苷的消光系数(26 900)；m，样品质量，g。

1.4 花青素成分分析

提取花青素滤液经转浓缩，后经孔径0.22 μm微孔滤膜过滤后上样分析，利用HPLC-MS液质联用分析仪检测花青素成分。

色谱条件：色谱柱选用 ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)。流动相A为乙腈，B为0.1%三氟乙酸，梯度洗脱程序：0～5 min，A 为 40%；5～7 min，A 为40%～70%；7～10 min，A 为 70%；10～11 min，A 为 100%；11～12 min A 为 40%，流速为 0.3 mL/ min，进样量2 μL，柱温为 30 ℃。

质谱条件：正离子模式，自动二级质谱扫描，扫描范围(质荷比)200～2 000，毛细管电压3 000 V，离子源温度为 300 ℃，干燥气温度为 350 ℃，干燥气流量为 600 L/h。

1.5 统计与分析

本研究使用Excel 软件统计数据，然后用Xcalibur软件分析花青素的质谱流图、一级质谱图、二级质谱碎片离子峰和综合保留时间，根据一级质谱的分子离子信息和二级质谱碎片离子，并结合相关文献[11-13]对各个色谱峰进行结构推断，鉴定羽衣甘蓝花青素的主要成分。

2 结果与分析

2.1 羽衣甘蓝花青素的组织定位

分别取植株心叶、外叶和茎，采用徒手切片法制成临时装片，在光学显微镜下直接观察花青素在紫叶羽衣甘蓝‘D07’和白叶羽衣甘蓝‘D06’中的分布。

由图2可知，紫叶羽衣甘蓝‘D07’心叶上下表皮邻近处均有一定花青素细胞分布，集中积累于上表皮下部2层叶肉细胞和下表皮上部的4层叶肉细胞中，其外观表现为整个心叶呈现紫色(图2(a))；而外叶中花青素集中分布在上表皮下部的1层叶肉细胞和下表皮上部2层叶肉细胞中(图2(b))，紫色层的数量在上部和下部都有所减少，表现为部分叶片呈紫色或叶脉呈紫色。在白叶羽衣甘蓝‘D06’的心叶(图2(c))和外叶(图2(d))中均未观察到花青素类物质的存在。

由图3可知，紫叶羽衣甘蓝上部茎、中部茎以及靠近基部的茎中都有花青素存在，集中积累于表皮细胞及表皮下2～4层薄壁细胞，在维管组织的韧皮部细胞中并没有发现花青素分布，整个茎外部表现为越靠近上部花青素分布越少(图3(a))，越靠近基部花青素积累的越多(图3(b))，紫色的程度越深。在白叶羽衣甘蓝‘D06’的茎(图3(c))中同样未观察到花青素类物质的存在。

综上，高浓度的花青素在组织中积累赋予了羽衣甘蓝华丽的紫色。绿叶白心羽衣甘蓝由于绿色叶绿素层存在而表现出茎和外叶均为绿色，白色心叶的呈现推测与入射光线在叶肉细胞间隙反复折射有关[14]。

比例尺为200 μm。The scale bar is 200 μm.图3 ‘D07’和‘D06’茎横切面Fig.3 Transverse section of stem in ‘D07’ and ‘D06’

2.2 温度对紫叶羽衣甘蓝花青素含量的影响

由图4可知，在20 ℃时，‘D07’心叶、外叶的花青素含量为0.255和0.013 mg/g，而10 ℃条件下生长，心叶和外叶的花青素含量为0.411和0.079 mg/g。结果表明，紫叶羽衣甘蓝‘D07’在 10 ℃ 环境下，整株叶片(心叶和外叶)中花青素含量均高于20 ℃条件中生长的叶片，可见低温对于花青素的合成有一定的促进作用。另外，在10和 20 ℃ 温度中生长，‘D07’心叶花青素含量均高于外叶，说明花青素在植株中的分布具有发育时期特异性。

图4 不同温度对羽衣甘蓝‘D07’心叶和外叶花青素含量的影响Fig.4 Effects of different temperatures on anthocyanin contents in inner and outer leaves of ‘D07’

2.3 紫叶羽衣甘蓝中花青素成分分析

本研究中，利用 HPLC-MS 技术对紫叶羽衣甘蓝心叶样品的花青素进行定性鉴定，该样品中共检测出38个高低不同的特征峰。这些特征峰的保留时间集中在 8～20 min。

由表1可知，在紫叶羽衣甘蓝‘D07’中共鉴定出矢车菊素和飞燕草素2大类花青素共9种花青素苷，分别为矢车菊素-3-葡萄糖-5-葡糖苷、矢车菊-3-槐糖-5-葡糖苷、矢车菊素-3-槐糖(对香豆酰)-5-葡糖苷、矢车菊素-3-槐糖(咖啡酰)-5-葡糖苷、矢车菊素-3-槐糖(阿魏酰)-5-葡糖苷、矢车菊素-3-槐糖(草酸酰-对羟基苯甲酰)-5-葡糖苷、矢车菊素-3-槐糖(芥子酰)-5-葡糖苷、飞燕草-3-葡糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖(咖啡酰)-5-葡糖苷，这些花青素的二级质荷比分别为287和303。然而，样品中并没有鉴定出二级质荷比分别为 301、317、331 和 271 的芍药色素、矮牵牛素、锦葵色素和天竺葵色素。紫叶羽衣甘蓝‘D07’的花青素主要以高度糖基化和酰基化的花青素苷为主，而且 77%以上的花青素都属于矢车菊素类衍生物。

表1 HPLC-MS 鉴定紫叶羽衣甘蓝中花青素的主要成分Table 1 Composition of anthocyanins in purple leaf kale identified by HPLC-MS analysis

表1(续)

表1(续)

3 讨 论

不同植物花青素在植株中定位存在一定的差异。非洲菊(GerberajamesoniiBolu)花瓣中花青素主要定位于栅栏组织，只有很少量分布于上下表皮[7]；而彩叶草中含有的花青素则集中积累于叶片上表皮细胞内[8]；紫叶突变甘蓝型油菜(Brassicanapus)的花青素分布在呈色的叶面表皮细胞层，花青素分布密度随着叶色变浅也随之降低[15]。即使在芸薹属植物之间其组织分布特征也有所不同。紫甘蓝、紫色芜菁叶片中花青素苷集中分布于表皮细胞[16]；紫色白菜叶片的花青素仅分布于上表皮细胞[17]；紫色花椰菜幼叶表皮下的细胞是花青素苷主要分布区[18]；而紫心大白菜叶片表皮细胞及表皮邻近的叶肉细胞中均有花青素分布[19]。

本研究中，紫叶羽衣甘蓝外叶和心叶中花青素主要分布于上表皮下的1～2层叶肉细胞和下表皮上的2～4层叶肉细胞中，表皮细胞中并未观察到花青素的存在，与紫色花椰菜花青素的组织分布特征一致，而茎中花青素的分布特征与紫心大白菜叶片中花青素分布特征类似，集中积累于表皮细胞及表皮下2～4层薄壁细胞。不同材料中存在的分布差异可能与花青素的合成机制和贮运方式有关。

芸薹属植物中花青素被鉴定出来的种类越来越多，紫色不结球小白菜(BrassicarapaL. ssp.chinensis)中就有20种左右的花青素被鉴定出来，以矢车菊素-3-槐糖(丙二酰)-5-阿拉伯糖(对羟基苯甲酰)和矢车菊素-3-芸香糖(芥子酰化的咖啡酰)-5葡萄糖为主[20]；而在紫色花椰菜(BrassicaoleraceaL. var.botrytis)中鉴定出以矢车菊素-3-槐糖(对香豆酰)-5-葡萄糖为主要成分的约10 种花青素[21]；紫色芥蓝 (Brassicajunceavar.tumidaTsen et Lee)中的花青素以矢车菊素-3-槐糖(芥子酰化阿魏酰)-5-葡萄糖(丙二酰)和矢车菊素-3-槐糖(阿魏酰)-5-葡萄糖(丙二酰)2种花青苷含量居多[22]；Zhu等[23]研究报道在羽衣甘蓝中鉴定出8种花青素成分，其中矢车菊素-3-双糖(芥子酰阿魏酰)-5-葡萄糖含量最高，其次是矢车菊素-3-双糖(芥子酰)-5-葡萄糖。以上研究中鉴定出的花青素大部分以矢车菊素为主。本研究从紫叶羽衣甘蓝纯系中检测到9种花青素组分，以矢车菊素为主，几种主要成分均为矢车菊-3-槐糖-5-葡糖苷中3号位被不同有机酸酰基化的衍生物，此外还含有飞燕草-3-葡糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖(咖啡酰)-5-葡糖苷2种飞燕草素成分。