UPLC-QTOF-MS技术在摩罗丹浓缩丸质量稳定性评价中的应用△

刘会云，田颖瑞，睢建亮，王梦蕾，殷苗苗，王珍

1.邯郸制药股份有限公司，河北 邯郸 056000；2.复旦大学 生命科学学院，上海 200030；3.河北工程大学 医学院附属医院，河北 邯郸 056000

中成药有效成分复杂，药效物质基础不明确，其质量稳定性与中药材的品种、产地、加工方式，以及成药的剂型和剂量、制剂加工工艺、制药设备、质量管理及控制方法、包装材料等因素有密切关系。窦志华[1]提出中成药最突出的问题是产品质量不稳定，不同厂家生产的同一产品，甚至是同一厂家不同批次的产品质量参差不齐。刘静等[2]基于国家样本抽验工作，提出影响中成药质量和安全的主要问题是原料质量和生产工艺。

摩罗丹浓缩丸作为由18味中药组成的大组方制剂，具有较好的临床效果[3-5]，其化学成分复杂，制剂工艺繁琐，并且产生药理活性的物质基础尚未明确；作为复方制剂，检测其中任何一种成分均不能体现其整体质量，中药中所含化学成分的种类和数量能比较全面地反映中药的内在质量[6-7]，所以通过对比不同批次间样本所含化学成分的种类和数量可以直接反映样本的质量稳定性。液质联用技术是指液相色谱串联质谱技术，适合复杂体系的成分分析，是目前复杂体系活性成分快速分离和鉴定的有力手段[8-10]。另外，主成分分析(PCA)在中药材和中成药的鉴别与质量分析中应用也较为广泛[11-13]。本研究利用超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱法(UPLC-QTOF-MS)技术对摩罗丹浓缩丸所含化学成分进行分析，并结合PCA，对样本的质量稳定性进行评价。

1 材料

1.1 仪器

Eksigent ekspert型超高效液相仪(AB Sciex公司)；Triple TOF 5600型高分辨质谱仪(AB Sciex公司)；Heraeus Fresco17型离心机(Thermo Fisher Scientific公司)；BSA124S-CW型天平(Sartorius公司)；JXFSTPRP-24型研磨仪(上海净信科技有限公司)；明澈 D24 UV型纯水仪(Merck Millipore公司)；PS-60AL型超声仪(深圳市雷德邦电子有限公司)。

1.2 试药

甲醇、乙腈、甲酸(LC-MS级，CNW Technologies公司)；L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技有限公司,纯度≥98%)。

摩罗丹浓缩丸共10个批次，生产批号分别为：00518072、00518073、00518074、00518077、00518084、00518086、00518088、00518089、00518090、00518097，由邯郸制药股份有限公司生产。

2 方法

2.1 样品溶液制备

称取100 mg摩罗丹浓缩丸粉末，加入500 μL含有内标(L-2-氯苯丙氨酸)的提取液(80%甲醇，内标质量浓度1 μg·mL-1)涡旋混匀30 s；冰水浴中超声处理1 h；将提取液在4 ℃，12 000 r·min-1(离心半径为859 mm)离心10 min；取出上清液，即得供试溶液。

2.2 分析方法

色谱条件：色谱柱为UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸-乙腈(B)；梯度洗脱(0～6.5 min，5%～30%B；6.5～12.5 min，30%～70%B；12.5～22 min，70%～100%B)；柱温为40 ℃。

质谱条件：本实验采用电喷雾离子源，雾化气压：377.24 kPa，辅助气压：377.24 kPa，气帘气压：241.32 kPa，温度：550 ℃，喷雾电压：5500 V(正离子模式)或-4000 V(负离子模式)。质谱仪在控制软件控制下基于数据依赖型扫描(IDA)功能进行一级、二级质谱数据采集。在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且>100的分子离子进行对应的二级质谱数据采集。轰击能量：40 eV，碰撞能差：20 V，15张二级谱图每50 ms。

2.3 数据处理

2.3.1数据处理方法 将原始质谱数据导入Progenesis QI软件，进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作，通过一级质谱精确质荷比和二级质谱碎片信息及相应裂解规律匹配法，结合中药数据库及相关文献对MS/MS数据峰进行物质鉴定。

2.3.2PCA 本研究使用SIMCA V14.1软件，对数据进行对数转换加中心化(CTR)格式化处理，然后进行自动建模分析。

2.4 方法学验证

在确定了供试溶液的制备方法和色谱分离条件后，通过参照相关文献，本实验对摩罗丹浓缩丸UPLC-QTOF-MS分析进行了方法学验证，考察仪器稳定性、内标响应情况[6-7]。

2.4.1稳定性 取10个不同批次的摩罗丹浓缩丸，按照2.1项制备方法平行制备得10个供试溶液，从这10个供试溶液中分别取出20 μL进行混合，得到质控(QC)样品，平行进行3次，得到3个QC样品，分别为QC-001、QC-002、QC-003；按2.2项下分析方法分别进样进行检测，QC样品的检测是穿插在10个供试样品检测中间，并在检测结束后按2.3.2项下分析方法对QC样品进行PCA。

2.4.2内标响应情况 对2.4.1项中所得3个QC样品中内标物L-2-氯苯丙氨酸按2.2项下分析方法进行检测。

3 结果与讨论

3.1 内标响应稳定性

通过对3个QC样品中内标物L-2-氯苯丙氨酸进行测定，得到3个总离子流分图谱，对这3个谱图进行叠加处理，结果见图1。

注：A.正离子模式；B.负离子模式；下同。图1 QC样品中内标L-2-氯苯丙氨酸的总离子流分图

由图1可以看到，正负离子模式下，QC样品中内标L-2-氯苯丙氨酸在总离子流分图中色谱峰的保留时间和响应强度重叠性较好，说明仪器在数据采集过程中的稳定性较好。

内标为外源引入的物质，QC样品中内标浓度相同，所以内标的响应差异越小(RSD≤20%)，说明系统越稳定，数据质量越高。通过对QC样品中内标进行响应差异分析，得出内标L-2-氯苯丙氨酸在QC样品中正、负离子模式下响应差异RSD分别为14.3%和15.7%，均小于20%，说明本次实验数据质量较高，系统较稳定。

3.2 摩罗丹浓缩丸的UPLC-QTOF-MS检测结果及不同批次样品间质量评价

3.2.1摩罗丹浓缩丸总离子流分图分析 因QC样品是由10个不同批次摩罗丹浓缩丸的供试品溶液混合得到的，为排除不同批次样本所含化学成分的差异，在对摩罗丹浓缩丸中所含化学成分进行定性分析的研究中，选择了QC样品作为研究对象。由于方法学验证结果良好，按2.2项下分析方法对QC-001样品进行测定，得到总离子流分图，结果见图2。

图2 摩罗丹浓缩丸QC样品总离子流分图

采用UPLC-QTOF-MS对摩罗丹浓缩丸样品进行测定，得到摩罗丹浓缩丸QC-001样品总离子流分图，根据该总离子流分图，按照2.3.1的数据处理方法，对总离子流分图中色谱峰进行物质鉴定。在正离子模式下，摩罗丹浓缩丸共鉴定出214种化学成分；负离子模式下，共鉴定出164种化学成分，正负离子模式下相同化学成分11种，所以摩罗丹浓缩丸中共鉴定出367种化学成分。

摩罗丹浓缩丸作为一个大处方制剂，所含化学成分较复杂，根据该药品的质量标准，仅有3项鉴别项和1项含量测定项，远远不足以反映药品的质量情况，这也是中药在质量控制方面的难点，利用UPLC-QTOF-MS技术快速一次性鉴定出该药品中所含的367种化学成分，能够较为全面地反映药品的质量情况。

根据中药化学成分的结构类型，对鉴定出的化学成分进行进一步分类，摩罗丹浓缩丸中含有64种三萜类物质、38种黄酮类物质、33种生物碱类物质、33种萜类物质、12种糖和苷类物质、10种有机酸及脂肪酸类物质、9种苯丙素类物质、4种氨基酸类及3种醌类物质等，其中三萜类、黄酮类、生物碱类及萜类数量较多，文献[14-15]表明，这几个种类中含有很多抗炎、抗菌、抗氧化药理作用的化学成分，通过对这些化学成分的进一步研究，能够进一步了解该药品的作用机理。

基于摩罗丹浓缩丸成分复杂多样，为了能够对其成分更加全面而系统的分析，笔者利用数据库，包括中科院上海有机所化学数据库(www.organchem. csdb.cn)、台湾中医药资料库(http：//tcm.cmu. edu.tw/)、Google scholar、Medline、CNKI、PubMed，根据摩罗丹浓缩丸组方中的药材，对这367种化学成分进行了药材一般来源归属，具体药材归属见表1。从表1可以看出，18味药材中鉴定出的化学成分数量不尽相同，其中来自茵陈、玄参、三七和延胡索中的化学成分较多，均超过30种。

表1 摩罗丹浓缩丸中所含化合物药材归属统计

3.2.2不同批次摩罗丹浓缩丸所含化学成分重复率分析 为了研究摩罗丹浓缩丸不同批次间的质量稳定性，本研究通过UPLC-QTOF-MS对10个不同批次的摩罗丹浓缩丸供试品溶液进行分析，得到各个批次样品的总离子流分色谱图，对这10个图谱进行了叠加处理，结果见图3。

图3 10个不同批次摩罗丹浓缩丸总离子流分叠加图

从图3中可以看出，正负离子模式下10个不同批次摩罗丹浓缩丸总离子流分图能够较好地重叠，从出峰时间和信号强度的重叠情况来看，样本各批次间所含化学成分种类及含量上均较相似，说明摩罗丹浓缩丸样本各批次质量差异性较小，总体质量稳定性较好。采用UPLC-QTOF-MS技术获得药品的总离子流分图，能够较全面地反映出药品的整体质量，该方法较稳定，且可重复性高。

为了更清晰地应用UPLC-QTOF-MS技术来表达各批次间样品所含化学成分种类的重复率，对各批样品鉴定出的化学成分种类及数量进行了进一步分析，结果见表2～4。

表2 正离子模式下不同批次样品所含化学成分重复率

表3 负离子模式下不同批次样品所含化学成分重复率

表4 正负离子模式下不同批次样品所含化学成分重复率

从表2～3可以看出，10个不同批次摩罗丹浓缩丸在正离子模式下鉴定出的化合物数量从193～209不等，不同批次样品间共有化合物数量为185个，所含化学成分的平均重复率为90%；负离子模式下鉴定出的化合物数量从154～159不等，不同批次样本间共有化合物数量为151个，所含化学成分的平均重复率达到96%。

从表4中可以看出，10个不同批次摩罗丹浓缩丸样品鉴定出总化学成分数量差距较小，最少341个，最多359个，共有化学成分为325个，各批次间所含共有化学成分的平均重复率达到92%。从不同批次样品所含化学成分种类的重复率角度来看，说明摩罗丹浓缩丸样品各批次质量差异性较小，质量稳定性较好。

3.2.3不同批次摩罗丹浓缩丸样品PCA 为从整体上比较摩罗丹浓缩丸不同批次间的质量稳定性，本研究按照2.3.2项下分析方法对10个批次的摩罗丹浓缩丸样品数据进行了PCA，得到10个批次样品PCA质量得分散点分布图和质量得分一维分布图，结果见图4～5。

图4 10个不同批次摩罗丹浓缩丸样品(n=10)PCA质量得分散点分布图

图4中椭圆代表95%置信区间，从图4可以看出，在正离子模式下00518073批次样品在第一主成分上与其他批次之间有分离趋势，而00518072和00518089批次样品在第二主成分上与其他批次之间有分离趋势，其他批次均较集中。结合图5样品PCA质量得分一维分布图可以看出，除00518073批外，其他批次质量小于2个标准差；在负离子模式下，从图4中可以看出各批次之间分布较离散，但结合图5发现，负离子模式下所有批次质量小于2个标准差；表明不同批次样品之间差异较小，总体质量较为稳定。综上所述，通过10个不同批次样品数据的PCA得出，摩罗丹浓缩丸药品总体质量稳定性较好，个别批次间略有差异。利用UPLC-QTOF-MS技术，结合PCA方法，能够从另一角度反映出药品多批次间的质量稳定性。

图5 10个不同批次摩罗丹浓缩丸样品PCA质量得分一维分布图

4 结论

本研究利用UPLC-QTOF-MS技术对摩罗丹浓缩丸的化学成分进行测定，鉴定出其含有367种化学成分，其中三萜类、黄酮类、生物碱类及萜类数量较多，比较全面地反映了摩罗丹浓缩丸的药效物质基础和质量情况，同时也为下一步该药品的药理作用研究提供参考；另外，通过对比10个不同批次样品所含化学成分的种类和数量，得出不同批次样品所含化学成分的平均重复率达到92%，进一步结合PCA结果，利用UPLC-QTOF-MS技术对摩罗丹浓缩丸的整体质量稳定性进行了更加全面地评价，10个批次样品除1个批次外的其他批次间的质量偏差较小，证明该药品的总体质量稳定性较好，个别批次之间略有轻微差异。本研究将UPLC-QTOF-MS技术应用到中药制剂的质量评价中，应用性强、稳定性高，为中药制剂的质量稳定性评价系统的建立提供了思路。