电针手厥阴心包经穴对脑缺血大鼠神经生长抑制因子及其受体表达的影响

2020-11-16肖豆谢峥嵘唐雅妮潘江曹越娄必丹章薇陈成

中国中医药信息杂志 2020年10期

肖豆，谢峥嵘，唐雅妮，潘江，曹越，娄必丹，章薇，陈成

肖豆1，谢峥嵘1，唐雅妮1，潘江2，曹越2，娄必丹2，章薇2，陈成2

1.湖南中医药大学，湖南长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007

观察电针手厥阴心包经穴对脑缺血后大鼠神经生长抑制因子及其受体表达的影响，探讨电针心包经穴对大鼠脑缺血后神经修复的作用机制。将SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、心包经组和肺经组，每组18只。颈外动脉插入线栓法制作局灶性脑缺血模型。成模后第2日起电针干预30 min，每日1次，干预6 d休息1 d，分别于7、14、21 d进行取材，每个时间点6只。ELISA检测血清神经生长抑制因子（Nogo-A）含量，RT-qPCR检测脑梗死区Nogo-A及其受体NgR1的mRNA表达。与同一时间点正常组和假手术组比较，模型组大鼠血清Nogo-A含量及脑梗死区Nogo-A和NgR1 mRNA表达各时间点均明显升高（＜0.01）；与同一时间点模型组比较，心包经组大鼠血清Nogo-A含量第21日及脑梗死区Nogo-A和NgR1 mRNA表达第7、21日明显降低（＜0.01），肺经组大鼠脑梗死区NgR1 mRNA表达第7日明显降低（＜0.05），NgR1 mRNA表达第14日明显升高（＜0.01）；与同一时间点肺经组比较，心包经组大鼠血清Nogo-A含量第21日明显降低（＜0.05），脑梗死区Nogo-A和NgR1 mRNA表达各时间点明显降低（＜0.01）。电针心包经穴可促进脑缺血后神经修复，其机制与下调模型大鼠血清Nogo-A含量、抑制缺血侧脑组织Nogo-A和NgR1的mRNA表达相关。

脑缺血；心包经穴；肺经穴；电针；神经生长抑制因子；神经修复；大鼠

脑梗死是指因大脑血液循环受阻，缺血、缺氧所致的局限性脑组织缺血性坏死或软化，进而引起相应神经系统功能缺损的一种疾病。针灸在脑缺血及相关疾病的临床治疗中应用广泛。有研究发现，针灸不仅对患者神经功能、机体功能恢复和并发症改善有良好的促进作用，而且还可对引起缺血性脑病相关的多种危险因素进行干预[1-5]。

本课题组前期研究表明，电针心包经穴能有效抑制脑缺血损伤心脑组织细胞凋亡，促进脑血管新生，增加大鼠血清、脑组织神经生长因子（NGF）的表达，降低血清神经生长抑制因子（Nogo-A）含量[6-8]。临床研究发现，电针心包经穴能减轻脑缺血患者偏身疼痛、麻木、感觉减退等症状，有效改善患者脑部供血[9-10]。本实验在前期研究基础上，以手厥阴心包经为整体受试因素，选取不同神经节段分布的4个腧穴（“天泉”“曲泽”“内关”“大陵”）代表整条经络，并选取多个时间点观察电针对脑缺血模型大鼠血清、缺血侧脑组织Nogo-A及其受体NgR1表达的影响，探讨脑缺血后神经修复可能的作用机制，为心包经穴在治疗脑缺血后神经损伤中的运用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康成年雄性SD大鼠90只，SPF级，3～4月龄，体质量220～250 g，湖南斯莱克景达试验动物有限公司提供。动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于室温22 ℃、相对湿度55%～70%环境，自由摄食饮水。饲养笼具、垫料、饲料、饮水均按SPF级实验动物要求进行制备和消毒，造模前禁食1 d。将SD大鼠随机分成正常组、假手术组各18只，造模组54只，成模大鼠随机分为模型组、心包经组、肺经组各18只，各组大鼠分别于7、14、21 d取材，每个时间点6只。

1.2 主要试剂与仪器

Nogo-A ELISA试剂盒（Andygene公司），mRNA反转录试剂盒、miRNA反转录试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）。0.30 mm×15 mm华佗牌一次性毫针、SDZ-Ⅱ华佗电针治疗仪（苏州医疗用品厂有限公司），全自动酶标洗板机（汇松PW-812），多功能酶标分析仪（汇松MB-530），荧光定量RCP仪（美国Thermo公司，PIKOREAL96），电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C）。

1.3 造模

参照Longa[11]和Koizumi[12]方法造模。从颈外动脉插入线栓建立大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。采用Zea Longa 5级4分制评分法评分。意识丧失、不能行走为4分；行走向偏瘫侧倾倒为3分；行走往偏瘫侧转圈为2分；梗死对侧伸直障碍、前爪内收为1分；无神经功能缺损为0分。选取评分为1～3分大鼠纳入实验观察。实验过程中对动物所有处置均符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》[13]。

1.4 干预

参照拟人比照法及《实验针灸学》[14]动物穴位图谱定位取穴，并按手三阴经脉“从胸走手”循行方向，选取梗死对侧肢体不同神经节段穴位代表心包经及肺经，即以“天泉”“曲泽”“大陵”“内关”代表心包经，以“天府”“尺泽”“列缺”“太渊”代表肺经。造模后第2日进行干预，毫针刺入梗死对侧上肢穴位，深度3～4 mm，接SDZ-Ⅱ型电针治疗仪，心包经组“大陵”“内关”相接、“曲泽”“天泉”相接，肺经组“太渊”“列缺”相接、“尺泽”“天府”相接，使近心端穴位接电针正极，远心端穴位接负极，选用连续波，输出电压2～4 V，以大鼠局部肢体轻颤为宜，干预时间30 min，每日1次，连续6 d，休息1 d，总计21 d。大鼠在正常喂养与捆绑处理的基础上，正常组不做任何处理，假手术组剥离出血管但不插线，模型组制作MCAO模型，心包经组电针心包经穴，肺经组电针肺经穴。

1.5 血清神经生长抑制因子含量检测

大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，取4～5 mL腹主动脉血，常温静置2 h，3000 r/min离心15 min，用移液枪取上清液，ELISA检测血清Nogo-A浓度，按照试剂盒说明书操作。所有数值使用Curve Expert软件进行分析并制作标准曲线。根据标准品OD值与浓度关系得回归方程，计算样本浓度（稀释样本×稀释倍数）。

1.6 脑梗死区神经生长抑制因子及其受体mRNA表达检测

大鼠断头取脑，取约0.02 g缺血侧海马组织，加入Trizol溶液，充分研磨匀浆后提取总RNA，再以组织总mRNA为模板，反转录cDNA（按反转录试剂盒说明书操作），取出部分cDNA，等比例混匀，稀释，作为实时荧光定量PCR模板。参照目的基因序列，运用Primer5软件设计引物（见表1），按SYBR法完成实验操作，反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40个循环。2-ΔΔCt法分析基因水平。ΔCt＝目的基因Ct－内参基因Ct，ΔΔCt＝对照组ΔCt－样品组ΔCt。

表1 PCR各基因引物序列

基因名称引物序列（5'～3'）产物长度/bp Nogo-A上游：TTGCCTTGCTTAGAATTGCCCTGT162 下游：GCCCATTTCTGTCTGAGGTTCCAA NgR1上游：ACAGTAATTCTGCTCTTGGTCAT146 下游：TGTCAGACCATTGAACAAGGC β-actin上游：ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC223 下游：TACTCCTGCTTGCTGATCCAC

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 电针对模型大鼠血清神经生长抑制因子表达的影响

与同一时间点正常组、假手术组比较，模型组大鼠血清Nogo-A含量各时间点均明显增加（＜0.01）；与同一时间点模型组比较，第21日心包经组大鼠血清Nogo-A含量明显减少（＜0.01）；与同一时间点肺经组比较，心包经组大鼠血清Nogo-A含量第21日明显减少（＜0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠不同时间点血清Nogo-A含量比较（±s，pg/mL）

注：与同一时间点正常组、假手术组比较，★★＜0.01；与同一时间点模型组比较，▲▲＜0.01；与同一时间点肺经组比较，●＜0.05

2.2 电针对模型大鼠脑梗死区神经生长抑制因子及其受体mRNA表达的影响

与同一时间点正常组和假手术组比较，模型组大鼠脑梗死区Nogo-A和NgR1 mRNA表达各时间点明显升高（＜0.01）；与同一时间点模型组比较，心包经组大鼠脑梗死区Nogo-A和NgR1 mRNA表达第7、21日明显降低（＜0.01），肺经组脑梗死区NgR1 mRNA表达第7日明显降低（＜0.05），NgR1 mRNA表达第14日明显升高（＜0.01）；与肺经组比较，心包经组大鼠脑梗死区Nogo-A和NgR1 mRNA表达各时间点明显降低（＜0.01）。结果见表3。

表3 各组大鼠不同时间点脑梗死区Nogo-A和NgR1 mRNA表达比较（±s）

注：与同一时间点正常组、假手术组比较，★★＜0.01；与同一时间点模型组比较，▲＜0.05，▲▲＜0.01；与同一时间点肺经组比较，●●＜0.01

3 讨论

中枢神经系统修复在脑缺血后患者的康复中占有至关重要的地位，而哺乳动物中枢神经系统的活跃生长、分化及可塑性调节均发生在胚胎及幼儿时期，成年哺乳动物中枢神经系统损伤后，神经细胞轴突大多难以再生和修复。目前认为神经修复好坏的关键主要取决于多种炎性介质及神经功能因子之间的相互作用[15]。Nogo-A是髓鞘中抑制轴突再生的因子，在中枢神经系统损伤后抑制轴突出芽和生长的过程中扮演着重要角色；NgR是Nogo-A的特异性受体，是中枢神经系统中广泛存在的特有蛋白质，其包含3个亚家族，即NgR1、NgR2、NgR3，其中NgR1与Nogo-A的亲和力最高[16-18]。

通过动物模型发现，Nogo-A抗体或NgR1拮抗剂能一定程度上下调Nogo-A及NgR1的表达，抑制缺血的同时在一定程度上促进神经修复及轴突再生，增强中枢神经系统的修复能力[19-20]。也有研究显示，Nogo-A和NgR1能抑制脑缺血后颈髓皮质脊髓束的结构和功能恢复，证实抗Nogo-A治疗能明显增加颈髓皮质脊髓束纤维的生长速度，通过NgR1拮抗剂治疗减轻脑缺血后造成的损伤，改善神经功能缺损[21-22]。另有研究发现，Nogo-A与NgR1通过特异性结合形成相应复合体激活RhoA及Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶，导致生长锥塌陷及神经突起回缩，从而抑制轴突再生[23]，表明Nogo-A和NgR1无论单独作用或形成复合体均有抑制轴突生长的作用。

目前，针灸在脑缺血后患者的康复中广泛运用。有研究发现，针灸通过调节神经生长因子、抑制因子及多种凋亡相关蛋白，抑制缺血半暗带神经细胞的凋亡、促进神经组织修复与重塑，从而保护缺血灶周围神经组织[24-25]。吴锋等[26]研究发现，电针“曲池”“合谷”在改善脑缺血大鼠神经功能的同时还能下调脑梗死区Nogo-A和NgR的表达。陈吉祥等[27]研究表明，电针“百会”“神庭”在抑制梗死侧海马区Nogo-A和NgR表达的同时可改善脑缺血再灌注大鼠学习和记忆能力。但研究选穴多为督脉和他经配穴，对手厥阴心包经与其他经脉对照研究鲜有报道。

我们将电针心包经穴作为一种外源性干预手段，观察大鼠脑缺血后多个时间点血清Nogo-A含量和脑组织Nogo-A和NgR1 mRNA表达的变化。本实验结果表明，模型组大鼠血清Nogo-A含量均应激性升高，与模型组比较，心包经组大鼠第21日血清Nogo-A含量减少，肺经组大鼠各时间点均未见明显变化，这可能与样本量小或/和Nogo-A在血清中表达不稳定有关。同时，模型组大鼠缺血侧脑组织Nogo-A和NgR1 mRNA表达各时间点均明显升高，电针心包经穴能明显降低模型大鼠缺血侧脑组织Nogo-A和NgR1 mRNA的表达，电针肺经穴在造模后7 d能有效下调NgR1 mRNA表达，但较心包经组不明显，说明电针对模型大鼠缺血侧脑组织NgR1 mRNA的调节具有经脉特异性，且心包经优于肺经。从中医基础理论来看，手太阴肺经虽不像心经、心包经一样与脑联系紧密，但“肺”具有“朝百脉，主治节”的生理功能，同时“主气、司呼吸”，能将流经肺脏的血液中浊气与清气交换，再通过宣发肃降作用将富含清气的血液输布全身，濡养大脑。依据这一理论，针刺肺经可促进脑缺血后的恢复，可能对Nogo-A及其受体NgR1有着相关的抑制作用。而电针肺经穴在第14、21日Nogo-A mRNA表达和第14日NgR1 mRNA表达均有上调。目前这一结果暂无其他相关实验结果可以参照，考虑与样本量小相关，具体原因需进一步研究。

本实验结果显示，电针手厥阴心包经穴能明显下调模型大鼠造模第21日血清Nogo-A的表达及第7、21日缺血侧脑组织Nogo-A和NgR1 mRNA的表达。但对模型大鼠第7、14日血清Nogo-A表达及第14日缺血脑组织Nogo-A和NgR1 mRNA表达无明显影响。脑为主要病变部位，梗死侧脑组织是Nogo-A最终作用部位。而脑缺血早期，血清中多种神经生长因子及抑制因子相互作用，在神经保护过程中，血清Nogo-A的表达可能受到血清中多种神经生长因子表达的影响[28]，导致不能稳定表达，所以造模后第7、14日未见血清Nogo-A表达的明显变化。而NgR1只在脑组织中表达，在其发挥抑制神经生长作用的过程中需与膜蛋白神经营养因子受体p75NTR和/或肿瘤坏死因子受体家族成员TROY及LINGO-1蛋白相互作用[29]，形成受体复合体，才能发挥抑制轴突生长的作用，这可能也是其表达不稳定的原因之一，需进一步研究。本实验结果显示，模型组大鼠脑缺血第7、14、21日，血清Nogo-A含量和缺血侧脑组织Nogo-A和NgR1 mRNA表达显著升高，电针心包经穴能促进脑缺血后神经修复，且具有经脉特异性，可为运用心包经穴治疗脑缺血后神经损伤提供一定的实验支持。

[1] 赵飞,王宁.针灸对急性脑梗死患者神经功能缺损的影响[J].中国医药指南,2018,16(7)：184-185.

[2] 魏瑞鹏,张建博,丛文东.针灸治疗脑梗死后认知功能的疗效及NHISS、ADL评分分析[J].吉林中医药,2019,39(10)：1373-1376.

[3] 张权,潘东,张津玮,等.调神复明针刺法治疗脑梗死后复视的临床观察[J].中西医结合心脑血管病杂志,2019,17(17)：2712-2714.

[4] 高霄英,丁少杰,鲁海,等.“醒脑开窍”针刺法对中风患者实验室指标影响概述[J].针灸临床杂志,2019,35(12)：79-83.

[5] 廖庆红,汪飞,陈诗莉.温针灸对恢复期脑梗死患者脑血流灌注情况及血清ICA M-1、IGF-1的影响[J].上海针灸杂志,2019,38(1)：45-49.

[6] 陈成,章薇,娄必丹,等.电针心包经穴对急性脑缺血大鼠血清及脑组织神经生长因子和神经生长抑制因子的影响[J].针刺研究,2015, 40(2)：94-98.

[7] 潘江,章薇,严洁,等.电针手厥阴心包经穴对大脑中动脉梗阻大鼠血清、脑组织中血管内皮生长因子的影响[J].针刺研究,2012,37(6)：197- 201.

[8] 石文英,严洁,章薇,等.基于心脑相关理论探讨电针心经、心包经穴对大脑中动脉梗阻大鼠心、脑细胞凋亡的影响[J].针刺研究,2019,44(2)：107-112.

[9] 何素娟,夏云,吕梓瑜,等.电针手厥阴心包经穴对脑梗死恢复期患者脑血流动力学即刻效应的影响[J].新中医,2016,48(5)：43-45.

[10] 李里,潘江,章薇,等.电针心经、心包经穴治疗丘脑卒中后感觉异常29例[J].中国针灸,2016,36(1)：102.

[11] LONGA E Z, WEINSTEIN P R, CARLSON S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke JT-Stroke；a Journal of Cerebral Circulation,1989,20(1)：84-91.

[12] KOIZUMI J, YOSHID Y, NAKAZAWA T, et al. Experimental studies of ischemic brina edema, a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirulation can be introduced in the ischemia area[J]. Stroke,1986,8：1.

[13] 中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物的指导意见[EB/OL].(2006-09-30)[2020-03-22].http://www.most.gov.cn.

[14] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社,2007：255-257.

[15] BERRY M, AHMED Z, LOGAN A. Return of function after CNS axon regeneration：Lessons from injury-responsive intrinsically photosensitive and alpha retinal ganglion cells[J]. Progress in Retinal and Eye Research,2019,2019：71.

[16] DENG B, GAO F, LIU F F, et al. Two monoclonal antibodies recognizing aa 634-668 and aa 1026-1055of NogoA enhance axon extension and branching in cultured neurons[J]. PLoS One,2014, 9：e88554.

[17] 贾波,黄伟,王天兵.Nogo蛋白与周围神经再生[J].中华肩肘外科电子杂志,2018,6(4)：241-243.

[18] 何梅,毛敏,赵国燕,等.Nogo-A对突触可塑性的调节及相关神经疾病[J].中国康复理论与实践,2019,25(2)：196-200.

[19] CRAVEIRO L M, WEINMANN O, ROSCHITZKI B, et al. Infusion of anti- Nogo-A antibodies in adult rats increases growth and synapse related proteins in the absence of behavioral alterations[J]. Exp Neurol,2013,250：52-68.

[20] RYU U, HAJIME T, JUN S, et al. Axonal regeneration and functional recovery driven by endogenous Nogo receptor antagonist LOTUS in a rat model of unilateral pyramidotomy[J]. Experimental Neurology,2017,2017：323.

[21] LINDAU N T, BANNINGER B J, GULLO M, et al. Rewiring of the corticospinal tract in the adult rat after unilateral stroke and anti-Nogo-A therapy[J]. Brain,2014,137(3)：739-756.

[22] GOU X, WANG Q, YANG Q, et al. TAT-NEP1-40 as a novel therapeutic candidate for axonal regeneration and functional recovery after stroke[J]. J Drug Target,2011,19(2)：86-95.

[23] IOBBI C, KORTE M, ZAGREBELSKY M. Nogo-66 restricts synaptic strengthening via Lingo1 and the ROCK2-cofilin pathway to control actin dynamics[J]. Cereb Cortex,2017,27(5)：2779-2792.

[24] 孙忠人,吕晓琳,尹洪娜,等.针刺调节脑可塑性的机制研究进展[J].针刺研究,2018,43(10)：674-677.

[25] 武晓娜,倪金霞,李苗苗,等.针刺对缺血性脑卒中神经组织凋亡与重塑的影响[J].环球中医药,2018,11(5)：787-791.

[26] 吴锋,李怀斌,赵健,等.电针结合天麻素对局灶性脑缺血大鼠神经功能、额叶皮质勿动蛋白A及其受体表达的影响[J].针刺研究,2016, 41(1)：65-69.

[27] 陈吉祥,林浴坤,吴羽楠,等.电针对脑缺血再灌注大鼠学习记忆功能及海马组织Nogo-A/NgR表达的影响[J].中国康复医学杂志,2015, 30(3)：219-223.

[28] 马纹蕊,武娟,洒玉萍,等.电针手厥阴心包经穴对MCAO大鼠血清、脑组织中NGF和Nogo-A的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(80)：221-223.

[29] 何梅,毛敏,赵国燕,等.Nogo-A对突触可塑性的调节及相关神经疾病[J].中国康复理论与实践,2019,25(2)：196-200.

Effects of Electroacupuncture Stimulation of Acupoints of Pericardium Meridian on Nogo-A and NgR1 Expression in Cerebral Ischemia Rats

XIAO Dou1, XIE Zhengrong1, TANG Yani1, PAN Jiang2, CAO Yue2, LOU Bidan2, ZHANG Wei2, CHEN Cheng2

To observe the effects of electroacupuncture (EA) stimulation of acupoints of pericardium meridian on Nogo-A and NgR1 expression in cerebral ischemia rats; To explore the mechanism of EA at the pericardium meridian on nerve repair after cerebral ischemia in rats.The SD rats were randomly divided into normal control group, sham-operation group, model group, pericardium meridian, and lung meridian group, with 18 rats in each group. The model of focal cerebral ischemia was selected and made by external carotid artery insertion thread embolization method. From the second day after successful modeling, EA intervention was performed for 30 minutes, once a day, intervention for 6 days and rest for 1 day. Serum and brain tissue were obtained on 7th, 14th and 21st day,with 6 rats at each time point. Serum nerve growth inhibitory factor (Nogo-A) was detected by ELISA. RT-qPCR was used to detect the expression of Nogo-A and its receptor NgR1 mRNA in cerebral infarction area.Compared with the normal control group and sham-operation group, the serum Nogo-A content and the expression of Nogo-A and NgR1 mRNA in the cerebral infarction area in the model group significantly increased at each time point (<0.01). Compared with the model group at the same time point, the serum Nogo-A content and the expressions of Nogo-A and NgR1 mRNA in the cerebral infarction area on the 7th and 21st days in the pericardium meridian group were significantly reduced on the 21st day (<0.01), the expression of NgR1 mRNA in the cerebral infarction area of the lung meridian group was significantly reduced on the 7th day (<0.05), and NgR1 mRNA expression increased significantly on the 14th day (<0.01). Compared with the lung meridian group at the same time point, the serum Nogo-A content in the pericardium meridian group was significantly reduced on the 21st day (<0.05), and the Nogo-A and NgR1 mRNA expression in the cerebral infarction area was significantly reduced at each time point (<0.01).EA stimulation of acupoints of pericardium meridian can up-regulate serum Nogo-A, and down-regulate the expressions of cerebral Nogo-A and NgR1 mRNA in cerebral ischemia rats, which is conducive to nerve repair after cerebral ischemia.

cerebral ischemia; acupoints of pericardial meridian; acupoints of lung meridian; electroacupuncture; Nogo-A; nerve repair; rats