猪PPARGC1A基因多态性与生长性状的关联分析及其表达

2020-11-12白莹张清阳韩海银张伟峰杨俊琦张辉刘玉芳

畜牧与兽医 2020年11期

白莹，张清阳，韩海银，张伟峰，杨俊琦，张辉，刘玉芳

(河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038)

随着人们生活水平的提高，猪肉品质引起了生产者和消费者的重视。如何提高猪肉品质是养猪业和猪遗传育种工作者的工作重点和研究目标，而这两方面的提高归根结底是要深入研究猪脂肪沉积和肌肉的生长发育[1]。脂肪沉积和肌肉的生长发育是十分复杂的过程，涉及大批基因的表达及网络式的调控。已有研究表明，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子lA(peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator 1A，PPARGC1A)是一个非常值得关注的基因，其最早在小鼠棕色脂肪cDNA文库筛选中被发现并报道[2]。作为关键性的核转录辅激活因子PPARGC1A可以和许多不同种转录因子结合，参与一系列有序的代谢过程，在调节线粒体生物合成、糖代谢、脂肪酸氧化、肌肉纤维类型转化等方面发挥着重要的作用[3-5]。

猪PPARGC1A基因定位于8号染色体，与脂肪酸合成和胴体性状相关的数量性状位点(QTL)共同定位[6-7]。研究表明PPARGC1A基因存在与板油、背膘厚和肉色等显著相关的单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs)[8-11]。同时，PPARGC1A基因在不同组织和生长阶段中的表达具有不同的模式。PPARGC1A基因在4月龄八眉猪肝脏、心脏和肌肉中表达最高，而在皮下脂肪和内脏脂肪中的表达最低[12]。太湖猪和长白猪肌肉组织中PPARGC1A基因的表达与背膘厚、脂肪细胞体积和肌纤维面积均呈负相关，脂肪组织中的表达与背膘厚、脂肪细胞体积和肌纤维面积呈正相关[13]。Li等[8]检测了PPARGC1A基因在滇南小耳猪和藏猪不同组织中的表达情况，结果显示PPARGC1A在背最长肌中表达最高，肝脏中次之，背膘中最低。在牛、羊和鸡中检测到PPARGC1A基因存在与生长性状(体重、日增重等)显著相关的多态性位点[14-16]，但在猪中PPARGC1A基因与日增重和饲料转化率的相关性还鲜有报道。

研究发现猪PPARGC1A基因启动子区存在g.17949513G>A多态性位点，该位点与肌纤维类型和数量显著相关 (P<0.05)[17]。该位点是否与生长性状和饲料转化率相关，是否会引起基因表达的变化还有待研究。本研究探讨PPARGC1A基因g.17949513G>A位点在杜洛克猪、长白猪以及大约克猪中的基因频率和基因型频率，分析该SNP位点不同基因型与达目标体重日龄、平均日增重、背膘厚和料重比的相关性，并检测该基因在大约克猪和金华猪不同组织中的表达，以探究该位点对猪生长性状的效应，以期为育种工作中利用PPARGC1A基因标记改良猪生长性状提供一定的基础和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究试验群体包括126头杜洛克猪、185头长白猪和224头大约克猪，所选个体3代之内没有亲缘关系。试验群体来自河北双鸽美丹畜牧科技有限公司，猪群的饲养管理条件基本一致，不同品种猪群均分3个批次进行性状测定。采集试验群体的耳组织样，并将其放于装有75%酒精的试剂盒中带回实验室，-20 ℃保存。基因表达试验中选取90日龄的大约克猪和金华猪各6头，屠宰后采取背脂和背最长肌组织样本，并迅速置于液氮保存，-80 ℃低温储存备用。

1.2 性状测定与分析

本研究采用美国奥斯本自动测定系统和MylabTouch超声诊断系统对试验群体进行性状测定。分析的性状包括达30 kg体重日龄、达50 kg体重日龄、达100 kg体重日龄、30～50 kg平均日增重、50～100 kg平均日增重、30～100 kg平均日增重、100 kg体重活体背膘厚和料重比。达30 kg体重日龄、达100 kg体重日龄、30～100 kg平均日增重和100 kg体重活体背膘厚的校正和计算方法参照种猪生产性能测定规程(NY/T 822-2004)和《家畜育种学》[18]；达50 kg体重日龄参照文献中的公示进行校正[19]；30～50 kg平均日增重和50～100 kg平均日增重根据校正的达30 kg体重日龄、达50 kg体重日龄、达100 kg体重日龄进行计算。

1.3 主要试剂

动物组织DNA提取试剂盒、总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。琼脂糖、DNA Marker Ⅰ等试剂购自北京汇天东方有限公司。

1.4 基因组DNA的提取及扩增

用DNA提取试剂盒从耳组织中提取基因组DNA。用猪特异性引物(F：5′-TGGAACATTATGGGCACTCA-3′，R：5′-AACCTGTTTGCTCTATGTCGTG-3′)对PPARGC1A基因进行PCR扩增。PCR反应体系为2×TaqPCR Mix 10 μL，上下游引物各0.2 μL，DNA模板 1 μL，补足ddH2O至20 μL。反应程序为95 ℃ 预变性10 min，95 ℃ 变性30 s，58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，36个循环，再延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海生工生物科技有限公司进行测序，对目的基因的多态性进行分析。

1.5 组织总RNA提取与cDNA合成

将采集的组织进行研磨，按照动物组织总RNA提取试剂盒说明书的步骤进行组织总RNA提取。利用NanoDrop 2000分光光度计检测提取RNA浓度和纯度。对合格的RNA进行反转录，反转录步骤按照反转录试剂盒方法进行反转录，质控合格后保存备用。

1.6 荧光定量PCR(RT-qPCR)检测PPARGC1A基因mRNA相对表达量

分别取金华猪和大约克猪背脂和背最长肌组织的cDNA，以GAPDH基因为内参，实时荧光定量PCR检测PPARGC1A基因的表达。反应体系为25 μL：2×qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol/L上下游引物2.0 μL(表1)，cDNA 2.5 μL，RNase-free水8.0 μL。PCR反应条件为：95 ℃，10 min为模板的预变性阶段；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环为模板的扩增阶段；60 ℃→95 ℃，每15 s缓慢升温0.3 ℃，建立熔解曲线阶段。

表1 荧光定量PCR引物

1.7 统计分析与数据处理

2 结果与分析

2.1 猪PPARGC1A基因启动子区g.17949513G>A多态位点检测

利用PCR进行片段扩增，采用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示PPARGC1A基因PCR扩增产物片段的长度为943 bp，条带单一、清晰明亮，符合预期的片段大小，没有非特异性条带。PPARGC1A基因的PCR扩增片段测序结果显示，在3个不同的试验猪种中存在g.17949513G>A多态性位点，共检测到GG、GA和AA三种基因型(图1)。

图1 PPARGC1A基因g.17949513G>A多态位点

2.2 猪PPARGC1A基因多态位点的基因和基因型频率及群体遗传特性

杜洛克猪、长白猪和大约克猪PPARGC1A基因g.17949513G>A位点的基因和基因型频率如表2所示。从基因型频率来看，长白猪中GG基因型频率最高(0.783 8)，在杜洛克猪和大约克猪中频率最高的基因型为GA(分别为0.476 2、0.678 6)，3个猪品种中AA基因型频率最低(分别为0.222 2、0.032 4、0.125 0)。从基因频率来看，杜洛克猪、长白猪和大约克猪中等位基因G的频率高于A，χ2检验的结果显示，g.17949513G>A位点在杜洛克猪和长白猪中符合Hardy-Weinberg平衡 (P>0.05)，而在大约克猪中未达到Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。从多态信息含量(polymorphism information content,PIC)的数值来看，杜洛克猪和大约克猪(分别为0.373 4和0.373 7)处于中度多态(0.25

表2 不同猪品种PPARGC1A基因g.17949513G>A位点的基因和基因型频率

2.3 猪PPARGC1A基因多态性与生长性状的关联分析

g.17949513G>A位点不同基因型与达目标体重日龄的关联分析结果显示(表3)，在3个猪品种中，GG基因型个体达到目标体重日龄均低于AA基因型和GA基因型个体，且在杜洛克猪中，GG基因型个体达到100 kg体重日龄显著低于AA基因型和GA基因型个体(P<0.05)。

表3 PPARGC1A基因g.17949513G>A位点不同基因型与达到目标体重日龄关联分析

与平均日增重关联分析结果显示(表4)，在杜洛克猪中，GG基因型个体30～100 kg平均日增重极显著高于AA基因型个体(P<0.01)，与GA基因型个体之间差异不显著(P>0.05)。在长白猪中，GG基因型个体50～100 kg平均日增重显著高于AA基因型个体(P<0.05)，与GA基因型个体之间差异不显著(P>0.05)。在大约克猪中，GG基因型个体的平均日增重高于其它两种基因型，但不同基因型个体之间日差异不显著(P>0.05)。

表4 PPARGC1A基因g.17949513G>A位点不同基因型与平均日增重关联分析

与100 kg体重活体背膘厚和料重比关联分析结果显示(表5和表6)，在3个猪品种中，不同基因型个体之间的100 kg体重活体背膘厚和料重比差异不显著(P>0.05)。在杜洛克猪和大约克猪中，GG基因型个体的料重比低于AA和GA基因型个体。但在长白猪中，料重比最低的是GA基因型个体。

表5 PPARGC1A基因g.17949513G>A位点不同基因型与背膘厚关联分析

表6 PPARGC1A基因g.17949513G>A位点不同基因型与料重比关联分析

2.4 PPARGC1A基因在金华猪和大约克猪背脂和背最长肌组织中的表达

利用RT-qPCR技术检测了PPARGC1A基因在大约克猪和金华猪中的表达情况。定量结果显示，PPARGC1A基因在大约克猪背脂和背最长肌组织中的表达显著高于金华猪(P<0.05)，见图2。同时，通过PCR直接测序的方法检测到定量所用的6头金华猪在g.17949513G>A位点的基因型为AA，而6头大约克猪在该位点的基因型为GG或GA。

图2 PPARGC1A基因相对表达量

3 讨论

PPARGC1A是一个与动物生长发育相关的重要调控基因。已有研究表明，猪PPARGC1A基因中存在多个与肉质性状和肌纤维类型显著相关的SNPs位点[8,11,17]，但与生长性状和料重比的相关性还鲜有报道。本研究检测了PPARGC1A基因启动子区多态位点g.17949513G>A在535头杜洛克猪、长白猪以及大约克猪中的遗传结构，并将其与平均日增重、达到目标体重日龄、100 kg体重活体背膘厚和料重比进行关联分析。结果表明，PPARGC1A基因g.17949513G>A位点在本研究试验群体中存在多态性。杜洛克猪、长白猪和大约克猪中G等位基因的频率高于A等位基因，这与Kim等[17]在长白猪和大约克猪中的研究结果一致。但Kim等[17]发现在长白猪和大约克猪中GG基因型的频率高于其他两种基因型，本研究结果显示长白猪中基因型频率最高的也是GG，而杜洛克猪和大约克猪中GA基因型的频率最高，造成这种差异的原因可能是群体的来源和数量不同。

关联分析结果可以看出，GG基因型个体达目标体重日龄低于AA基因型和GA基因型个体，平均日增重高于AA基因型个体。在杜洛克猪中，GG基因型个体达到100 kg体重日龄显著低于AA基因型和GA基因型个体，GG基因型个体30～100 kg平均日增重极显著高于AA基因型个体。在长白猪中，GG基因型个体在50～100 kg平均日增重显著高于AA基因型个体。同时，PPARGC1A基因在生长速度快的大约克猪背脂和背最长肌组织中的表达要高于生长速度慢的金华猪。已有研究表明，GG基因型与Ⅰ型肌纤维含量和产肉性状(眼肌面积)显著正相关[17]，同时PPARGC1A基因的高表达与Ⅰ型肌纤维含量显著正相关[20]。在出生体重不同的猪中，体重大的个体I型肌纤维含量要显著高于体重小的个体[21]。因此，该位点的变异可能会影响PPARGC1A基因的表达，从而改变肌纤维的类型和含量，对个体的生长发育有一定的影响。但其具体的作用机制还需要通过细胞和分子水平试验的进一步验证。

在3个猪品种中，PPARGC1A基因g.17949513G>A位点的不同基因型个体之间的活体背膘厚差异不显著，这与Kim等[17]的研究结果一致。饲料效率对猪养殖业和经济效益有重要的影响，通过GWAS分析表明PPARGC1A基因可能是饲料效率相关的一个重要候选基因[22]。在本研究中，g.17949513G>A位点不同基因型与料重比关联分析结果显示，虽然不同基因型个体之间料重比差异不显著，但在杜洛克猪和大约克猪中，GG基因型个体的料重比低于AA和GA基因型个体。在长白猪中，料重比最低的是GA基因型个体。