稻纵卷叶螟Calreticulin基因的鉴定与功能分析*

谢敏欣，宋月楠，何娜娜，夏涛，江嘉琳，余海中,†

(1.赣南师范大学 生命科学学院；2.国家脐橙工程技术研究中心，江西 赣州 341000)

稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)属于鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，是一种主要的水稻害虫.迄今为止，在印度，韩国，日本，中国，马来西亚，斯里兰卡和越南等亚洲国家均有报道[1].它的幼虫主要取食生长期的水稻幼苗，而成虫可以在夜间持续长时间的飞行[2-3].稻纵卷叶螟的防治主要包括化学防治，物理防治和生物防治，其中以化学杀虫剂防治为主，但是化学杀虫剂的不合理使用引发了一系列的问题，如环境污染、农药残留和害虫抗药性[4-5].

CRT是一种Ca+结合蛋白，也是一种重要的分子伴侣，主要参与内质网膜上糖蛋白的合成[6].CRT含有三个典型的结构域：N端的信号肽，P结构域的二硫键以及C端的内质网膜识别序列(-HDEL)，它们对CRT结构的稳定性及活性有一定的影响[7].近年来，CRT在不同的生物类群中均有报道，如在哺乳动物中，CRT主要参与一些胞内与胞外的过程，如调控凝集素的合成，Ca+的储存，基因的表达及先天性免疫反应[8].Wang等人从菜粉蝶(Pierisrapae)的基因组数据库中克隆了CRT基因并研究其功能，其结果显示PrCRT在血细胞表达量较高[9].Cha等人从菜蛾盘绒茧蜂(Cotesiavestails)的毒腺cDNA文库中鉴定出Cp-CRT基因，并且在大肠杆菌中高效表达出Cp-CRT蛋白，发现它对结节具有一定的抑制作用[10].迄今为止，稻纵卷叶螟CRT(CmCRT)基因的研究还未见报道.

在本研究中，基于稻纵卷叶螟转录组数据库，我们鉴定了2个稻纵卷叶螟CRT基因，通过相应软件预测了其分子特征及功能.通过RT-qPCR 分析CmCRTs在稻纵卷叶螟的不同组织及不同发育时期的相对表达量以及.CmCRT1基因在大肠杆菌(E.coli)诱导下的表达模式.这些研究成果将为进一步研究CmCRT的功能奠定基础.

1 材料与方法

1.1 稻纵卷叶螟的饲养，细菌准备与样品的准备

稻纵卷叶螟(C.medinalis)幼虫采集自安徽省农业科学院水稻研究所，采用新鲜的水稻叶片进行人工饲养，分别收集稻纵卷叶螟1龄、2龄、3龄、4龄幼虫、蛹以及成虫；对4龄幼虫进行组织解剖，获取幼虫的头部，中肠，血淋巴，表皮和脂肪体等组织，加适量液氮充分研磨，按照100 mg/mL的比例加入Trizol充分混匀，然后保存于-80 ℃.

过夜培养的大肠杆菌7 500 g，离心15 min收集菌体，然后使用0.85% NaCl清洗3次，最后加入适量的0.85% NaCl重新悬浮，并进行高温灭活处理.取4龄第1天的稻纵卷叶螟幼虫，使用微量注射器，每头幼虫注射5 μL灭活后的大肠杆菌(1×107)，为防止液体流出，注射后的伤口使用凡士林处理，分别收集注射后4 h，8 h，12 h和24 h稻纵卷叶螟幼虫，0 h作为对照，每个处理进行3个生物学重复，收集后的样品加适量液氮充分研磨，按照100 mg/mL的比例加入Trizol充分混匀，然后保存于-80 ℃.

1.2 稻纵卷叶螟各组织总RNA提取及cDNA的合成

根据Trizol试剂使用说明书，分别从稻纵卷叶螟的表皮，头，中肠，脂肪体及血淋巴中提取总RNA，并且测定其浓度与纯度.将总RNA使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA synthesis Kit反转录试剂盒处理，完成cDNA的合成.-20 ℃保存.

1.3 CmCRTs的鉴定与生物信息学分析

基于稻纵卷叶螟转录组数据库，通过BLASTX软件搜索稻纵卷叶螟(C.medinalis)非赘余蛋白质数据库(cut-off为1×10-5)，获得候选的CRT基因序列.通过在线软件(https://web.expasy.org/compute_pi/)分析CmCRTs的分子量及等电点；通过ORF finder在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析CmCRTs基因的开放阅读框；通过SignalP 4.1 Sever 在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析CmCRTs的信号肽序列.基于NCBI保守域数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)获得CmCRTs的保守域序列.通过SWISS-MODEL在线软件(http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html))构建CmCRTs蛋白质模型与并对其进行分析.通过 DNAMAN 7.0 software软件获得CmCRTs的氨基酸同源序列.通过MEGA 5.0 软件采用邻接法构建CmCRTs系统发育树.

1.4 稻纵卷叶螟CmCRTs基因的时空表达分析

基于已经获得CmCRTs序列，通过RT-qPCR进一步分析CmCRTs在稻纵卷叶螟不同组织以及不同发育时期的相对表达水平.具体的引物见表1，RT-qPCR反应体系如下：SYBR Ⅱ12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，forward primer 1.0 μL，reverse primer 1.0 μL，cDNA模板1 μL.反应条件为：50 ℃预热2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环.每个反应执行三个生物学重复.反应均在Multicolor RT-PCR Detection System(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)实时定量PCR仪上完成.反应中内参基因为CmActin基因.利用2-ΔΔCt相对定量法分析基因的相对表达量.利用SPSS软件进行差异显著性分析.

表1 本研究所用的引物

1.5 稻纵卷叶螟总蛋白的提取及Western blot分析

采用Western Blot确定被大肠杆菌(E.coil)处理后的稻纵卷叶螟(C.medinalis)4龄幼虫的钙网蛋白的丰度.取100 mg样品粉末；加1 mL protein lysis buffer，配比体系为7 M 尿素，2 M硫脲，4% CHAPS，10 mg DDT；采用12% SDS-PAGE电泳分离蛋白质；将已分离蛋白质转移至PVDF膜上；含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭1 h，PBST配比体系：137 mM NaCl,，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KHPO4，pH7.5,0.1%(v/v)Tween-20；PBST清洗3次；加入CmCRT1抗体(稀释倍数1∶1000)，室温孵育2 h；PBST清洗3次；加入适量封闭缓冲液与二抗即辣根过氧化物酶标记羊抗兔(稀释倍数：1∶5000)，孵育1 h；除去缓冲液，PBST清洗3次，加入显影剂；通过Bio-Rad GS-800扫描仪观察显色结果.

2 结果分析

2.1 CmCRTs的cDNA序列与结构分析

基于cDNA数据库，获得CmCRT1及CmCRT2的全长cDNA序列.2种CmCRTs的序列长度，相对分子质量，等电点及其他基本信息如表2所示.通过Signal P 4.1软件分析CmCRTs结构，结构显示CmCRT1的信号肽由19个氨基酸构成(MKSLVLAVVSLLAIYSVNC)，而CmCRT2的信号肽由16个氨基酸构成(MFHFCVVILLLYTARA).基于推断出的CmCRTs的氨基酸序列，确认了CRT家族的重复模体(motif A and motif B)及重复序列(IxDxExxKPE(/D)DW.CmCRTs的C端含有假定的内质网膜靶向4肽HDEL，如图1及图2所示.

图1 CmCRT1的全长cDNA序列及对应的氨基酸序列 图2 CmCRT2的全长cDNA序列及对应的氨基酸序列

表2 CmABC序列的特征

通过SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在线软件预测CmCRTs的三级结构，结果显示CmCRTs包含凝集素结构域及ARM域，此外，CmCRTs的C端主要由β-折叠组成，如图3所示.

图3 稻纵卷叶螟CmCRTs的结构特征

2.2 CRT的氨基酸序列比对

如图4所示，氨基酸序列比对分析揭示稻纵卷叶螟CRT与其他昆虫物种CRT序列保持较高的同源性，进一步暗示它们在功能上较为保守.

图4 CmABC与其他13种昆虫的氨基酸序列比对 图5 稻纵卷叶螟CmCRTs的系统发育树

2.3 昆虫CmCRTs的系统发育树分析

选择鳞翅目(Lepidoptera)蜡螟(Galleriamellonella)，桑蚕(B.mori)，菜粉蝶(Pierisrapae)，小菜蛾(Plutellaxylostella)，玉带凤蝶(Papiliopolytes)，柑橘凤蝶(Papilioxuthus)，松白条尺蠖(Operophterabrumata)，黑脉金斑蝶(Danausplexippus)，双翅目黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)，冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)，斯氏按蚊(Anophelesstephensi)，膜翅目(Hymenoptera)无刺峰(Meliponaquadrifasciata)，蝶蛹金小蜂(Pteromaluspuparum)，丽蝇蛹集金小蜂(Nasoniavitripennis)与稻纵卷叶螟(C.medinalis)进行氨基酸同源性分析，并构建邻接系统发育树，从而更好地了解CmCRTs基因与其他昆虫的进化关系.结果显示CmCRT1的氨基酸序列与蜡螟(G.mellonella)的GmCRT序列亲缘关系较近，而CmCRT2序列则分别与PpCRT序列及NvCRT序列都有99% 的同源性，如图5所示.

2.4 CmCRT基因的时空表达分析

为了确定CmCRTs基因在稻纵卷叶螟(C.medinalis)幼虫不同组织及其不同发育阶段的表达模式，利用荧光定量PCR对幼虫的中肠，表皮，血淋巴，脂肪体及头，以及对处于1龄，2龄，3龄，4龄阶段及蛹，成虫期的相对表达量进行检测.结果显示，CmCRT1在稻纵卷叶螟幼虫组织中的表达模式为：在血淋巴中的表达量为在表皮中的表达量的7.58倍，在脂肪体中的表达量为在表皮中的表达量的3.3倍，而在头及表皮中的表达量类似；CmCRT1在稻纵卷叶螟不同发育阶段的表达模式为：相对于蛹期及成虫期，在虫体早期(1龄，2龄，3龄，4龄)低表达；CmCRT2则在血淋巴中高表达，为在头中的12.57倍，在脂肪体中的表达量为在头的9.77倍；CmCRT2在稻纵卷叶螟的1龄至3龄第1天低表达，但在3龄第1天之后的表达量迅速增多，直至蛹期，如图6所示.

图6 CmCRTs基因的时空表达分析

2.5 CmCRT在经免疫刺激后稻纵卷叶螟幼虫中的表达模式

CRT基因在许多微生物中已成功被诱导表达.为了确定CmCRTs在经免疫刺激后的稻纵卷叶螟(C.medinalis)幼虫中的表达模式，利用RT-qPCR及Western blot检测其在幼虫整体中的表达量.结果显示，经大肠杆菌(E.coli)处理4 h时，CmCRT1基因的mRNA表达量显著上调，而在4 h至8 h时间段内则下降；在经大肠杆菌(E.coli)处理24 h时，CmCRT1基因的mRNA表达量对比其在12 h时的表达量保持在一个较高的水平；而CmCRT1蛋白质的表达量在幼虫经大肠杆菌(E.coli)免疫刺激后的不同时间中的表达量与其mRNA在相对应的时间段的表达模式类似，如图7所示.

图7 稻纵卷叶螟幼虫在经不同时间大肠杆菌免疫刺激后CmCRT1基因的表达量

3 讨论

钙网蛋白主要参与细胞内钙离子稳态及内质网钙库的调控并且影响钙库操控性钙内流及在胚胎发育过程中依赖钙离子的转录途径.之前的研究表明CRT在昆虫免疫过程中起着重要作用[11].Zhang等人的研究表明微红盘绒茧蜂(Cotesiarubecula)的CRT可以与宿主红细胞内的CRT竞争结合位点，从而影响包囊作用的发生.利用酵母细胞进行的比较吞噬试验表明不同昆虫血细胞的吞噬潜能及相对的CRT参与性有显著差异[12].在本研究中，基于cDNA数据库，我们确认了2种CRT基因，即CmCRT1及CmCRT2.基于保守域分析，我们预测CmCRT1及CmCRT2均包含3种结构域：-N域上的二硫桥，-P域上的2种重复模体(模体A与模体B)，-C域上的内质网识别域，均具有多种功能.-P域与-C域分别含有大量对受体亲和力强的结合位点.此外，CmCRT1及CmCRT2的N端均含一段信号肽序列.我们推测这2种CRT均为分泌蛋白.RNA干扰及蛋白敲除实验表明昆虫CRT的-N域参与了包囊作用.哺乳动物CRT的-N域中的钙离子结合位点对CRT结构的稳定性起着一定的作用.-P域中的脯氨酸富集区及重复序列可与内质网膜上的第57号蛋白及肽基脯氨酸顺发异构酶相互作用.酸性的-C域参与细胞内钙离子稳态，并且还包含指定作用于内质网膜上的-HDEL序列.通过SWISS-MODEL分析显示CmCRTs包含2个域，即ARM域及凝集素结构域.其余结构形成了一个小的结构化区域，即我们所谓的连接区，连接了ARM域与凝集素结构域.据推测，该结构可能为CRT可发挥伴侣蛋白功能的原因.CmCRTs的分子结构特征分析显示其可能在稻纵卷叶螟(C.medinalis)中发挥已在其他生物中报道的多种功能.

CRT是一种在内质网膜上含量丰富的结构保守的可溶解的蛋白质.它广泛存在于动植物体内，甚至出现在动植物王国出现之前[13].因此，CRT家族成员在进化过程中仍保持较高的保守性.基于其推测的氨基酸序列所进行的同源性比对及系统发育树分析显示相对于其他目而言，CmCRT1与鳞翅目(Lepidoptera)有较高的同源性，尤其是蜡螟(Galleriamellonella)；而CmCRT2则与膜翅目(Hymenoptera)有较近的亲缘关系，如蝶蛹金小蜂(Pteromaluspuparum)及丽蝇蛹集金小蜂(N.vitripennis)，结果显示CmCRT1与CmCRT2的功能有所差异[14].

CRTs在不同物种的不同组织及不同发育阶段中的表达量均有所差异.在长红锥蝽(Rhodniusprolixus)中，相对于卵母细胞形成期及产卵期，卵子形成的后期中的CRT基因的表达量较低，该结果显示CRT除在胚胎发育过程中发挥重要作用，还在新分子及钙信号的合成过程中发挥作用[15].Cheng等人利用far-western blotting 及质谱法在蚕的中肠中确定了一种CRT，并且对RT-qPCR的数据进行分析，结果显示BmCRT基因的表达量在感染了BmNPV的蚕中及对照组中均下调[16].在本研究中，结果显示CmCRT1及CmCRT2在血淋巴中高表达，其次便是脂肪体及中肠.昆虫的中肠及脂肪体被视为主要的新陈代谢组织.因此，CmCRT1及CmCRT2在血淋巴及中肠中高表达显示CmCRTs由脂肪体合成，分泌至血淋巴参与免疫反应.CmCRT1及CmCRT2在不同发育阶段的相对表达量分析显示其在蛹期及成虫期高表达，而在幼虫的早期(1龄，2龄，3龄，4龄)低表达.但是，钙网蛋白在蛹期及成虫期高表达的原因至今不明，因此还需进行更多的关于稻纵卷叶螟(C.medinalis)钙网蛋白生理功能的深入研究.利用RT-qPCR及Western blot分析确定CmCRT1在经免疫刺激后稻纵卷叶螟(C.medinalis)幼虫中的表达模式，结果显示CmCRT1基因的mRNA表达量在被大肠杆菌(E.coli)处理4 h后显著上调，在被处理8 h时锐减，在24 h时恢复至原始水平，这种情况与经大肠杆菌(E.coli)处理后BmCRT的表达模式一致.Takahashi等人曾检验家蚕(B.mori)中的BmCRT是否可以在脂肪体中参与体液免疫，结果显示BmCRT在被大肠杆菌(E.coli)处理6 h时被显著诱导表达[17].在之前的研究中，Asgari等人发现昆虫的钙网蛋白可以结合于血细胞的表面并且参与细胞的包囊作用.因此，我们推测CmCRTs可能也在免疫方面发挥重大作用[18].

总而言之，首先，我们鉴定了2种稻纵卷叶螟(C.medinalis)的钙网蛋白基因序列，之后基于生物信息学分析，RT-aPCR及Western blot分析它们的结构及表达模式，为进一步研究稻纵卷叶螟(C.medinalis)钙网蛋白功能奠定基础.