液质联用法测定鸡肉中甲基睾酮的不确定度评定

焦绍明，李卿沛，代春梅，徐尚喜

（金昌市农产品质量安全检测中心，甘肃 金昌 737100）

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1290-6460C型液质联用仪（美国Agilent公司）；IKA VXR涡旋振荡器（艾卡公司）；Smart-N30VF超纯水机（力康公司）；感量为0.01 g、0.1 mg的电子天平（德国赛多利斯公司）；1 000 μl移液器（德国普兰德公司）；Agilent Bond Elut C18固相萃取柱（500mg/3 ml，Agilent公司）。

甲基睾酮标准品：50mg，Stanford Chemicals。乙腈、甲醇：色谱纯，美国Fisher公司。试验用水为超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制 准确称取10 mg甲基睾酮标准品，用甲醇定容至于100 ml容量瓶中，配制成100 mg/L的标准储备液。取0.1 ml标准储备液用甲醇定容至10 ml，配制成1mg/L的标准中间液，于-18℃冰箱中保存。

1.2.2 前处理方法 称取2 g糜状鸡肉样品于50 ml离心管，加入10 ml乙腈，涡旋振荡5 min，超声提取10 min，10 000 r/min离心10min，取上清液至鸡心瓶，残渣重复提取一次，合并上清液于鸡心瓶中，40℃负压旋蒸至干，加入5ml 30%甲醇水溶液溶解残余物，待净化。

C18固相萃取柱预先用3ml甲醇、3ml水活化，上述待净化溶液全部过柱，用2 ml30%甲醇水溶液淋洗小柱，抽干后使用3 ml90%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液于40℃下氮气吹干，用1 ml 50%甲醇水溶液溶解残渣，过0.22μm微孔有机滤膜后待检测。

1.3 仪器条件

色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温为35℃；流动相A为含0.1%甲酸的超纯水，B为含0.1%甲酸的乙腈；液相流速为0.25 ml/min；梯度洗脱为0 min 90%A，2 min 60%A，4 min 40%A，6 min 15%A，7 min 20%A，9 min 90%A。电喷雾正离子模式（ESI+）；多反应监测（MRM）；甲基睾酮离子对：303.2/109（定量）、303.2/97.1；传输电压为119V。

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1.4 基质匹配标准溶液配制

取空白鸡肉样品按照前处理步骤制备基质溶液，用基质溶液将标准中间液逐级稀释成浓度为200 μg/L、100 μg/L、50 μg/L、20 μg/L、10μg/L、5 μg/L的基质匹配标准溶液。

1.5 建立数学模型

甲基睾酮含量计算公式：

式中：X为样品中甲基睾酮的含量（μg/kg）；C为样品中甲基睾酮浓度（μg/L）；V为样品最终定容体积（ml）；m为样品质量（g）。

2 不确定度分量主要来源

2.1 配制标液引入的不确定度

由标准品纯度以及配制标准品使用的天平、移液管、容量瓶等的最大允许误差引入。

2.2 样品称重引入的不确定度

由称重天平的最大允许误差引入。

2.3 最终定容体积引入不确定度

由最终定容体积使用移液器的最大允许误差引入。

2.4 标准曲线引入的不确定度

由最小二乘法拟合标准曲线校准C引入。

2.5 实验回收率引入的不确定度

由前处理步骤对回收率的影响引入。

2.6 液质联用仪引入的不确定度

由仪器检测过程引入。

3 测量不确定度的计算

3.1 配制液引入的不确定度

3.1.1 标准品纯度引入的不确定度 标准物质证书给出甲基睾酮标准品的纯度为98.85%±1.0%，取矩形分布（k=3），引入不确定度为：

3.1.2 配制标准储备液引入的不确定度 根据检定证书，感量0.000 1 g电子天平的最大允许误差为±0.001 5g，取矩形分布（k=3），引入不确定度为：

根据检定证书，100 ml容量瓶的最大允许误差为±0.1 ml，取矩形分布（k=3），引入不确定度为：

3.1.3 配制标准中间液引入的不确定度 根据检定证书，0.1 ml移液管的最大允许误差为±0.004 ml，取矩形分布（k=3），引入不确定度为：

根据检定证书，10 ml容量瓶的最大允许误差为±0.02ml，取矩形分布（k=3），引入不确定度为：

3.1.4 配制标液引入的相对标准不确定度

3.2 样品称重引入的不确定度

根据检定证书，感量0.01g电子天平的最大允许误差为±0.05g，取矩形分布（k=3），引入不确定度为：

3.3 最终定容体积引入的不确定度

根据检定证书，1 000 μl可调式移液器的扩展不确定度为0.5μl（k=2），引入不确定度为：

3.4 标准曲线引入的不确定度

配制5、10、20、50、100、200μg/L等6个浓度的基质匹配标准工作液，分别测试3次，测量结果用最小二乘法拟合得到线性回归方程：y=303.38x-266.31（R2=0.9992），=64.167μg/L，峰面积测量的标准偏差S为：

配置浓度为50μg/L的基质匹配标准溶液，重复测定6次，峰面积结果见表1，测定样品中甲基睾酮含量的平均值C0=50.79μg/L。

引入不确定度为：

3.5 试验回收率引入的不确定度

称取2 g空白鸡肉样品，添加甲基睾酮标液至20 μg/kg，做6个平行样品进行测定，计算其含量和回收率，含量平均值=20.38μg/kg，回收率见表2。

引入不确定度为：

3.6 液质联用仪引入的不确定度

根据检定证书，液质联用仪的不确定度为U=10%，k=2，引入不确定度为：

3.7 合成相对标准不确定度及扩展不确定度

3.7.1 各分量合成相对标准不确定度

3.7.2 扩展不确定度

取包含因子k=2，在95%置信水平下，甲基睾酮扩展不确定度为：

3.8 结果报告

4 结论

通过对不确定度引入各个分量的评定来看，液质联用仪测定、标液配制和回收率引入的不确定度较大，在实验中应尽可能规范操作，以提高测量精确度。

表1 重复进样测定结果峰面积

表2 鸡肉中甲基睾酮加标回收测定结果