sIgA细胞在初生牦牛小肠的分布研究

宋 晨，张 倩，崔 燕，何俊峰，拜占春，刘嘉琪，马志宏

（甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070）

小肠（Small Intestine）是动物消化系统关键的组成部分之一，由十二指肠、空肠、回肠共同构成。小肠不仅能够消化食物，而且还能够很好地吸收营养物质，不仅如此，小肠同时还能起到免疫屏障的作用。当前，关于小肠组织结构进行的研究与报道，主要是集中于兔、猫、羊[1]、以及藏羚羊[2]等动物。根据这些研究报道显示，小肠壁层的构成包括了黏膜层、黏膜下层、肌层以及浆膜，而且小肠黏膜上还具有微绒毛、肠绒毛、环形褶皱以及小肠腺等具有代表性的结构。除此之外，在小肠黏膜上面还分布有很多与黏膜有关的淋巴样组织，包括有淋巴细胞、肥大细胞、巨噬细胞等等。小肠黏膜组织所具有的这些结构不仅能够增大小肠黏膜的表面积，而且还可以提高小肠对营养物质的吸收效率，同时小肠组织中相关细胞还参与构成了肠道的免疫防御屏障，这些使得小肠黏膜兼具了良好的吸收作用和屏障功能。

消化道黏膜免疫的主要效应因子为分泌型免疫球蛋白A(secretoryIgA，sIgA)，同时消化道黏膜免疫系统的首要防线也是由sIgA而构成的。首先，sIgA不仅能够中和病毒、抵御病原菌，其次，它还能够实现免疫清除、免疫排斥。除此之外，sIgA还可以调节肠道的微生物构成情况，并且还可以促使形成得到更多的天然抗菌因子[3]。当前，关于消化道sIgA细胞分布情况的研究，主要集中在猪、家兔、双峰驼等动物[4-6]且均已有报道。

牦牛是主要分布在我国青藏高原等地区的特有牛种之一，能够很好地适应高寒的气候环境。牦牛不仅仅可用于农耕，而且还能够作为高原运输工具，更可以为当地牧民提供奶、肉、皮毛、役力、燃料等生产生活必需品，是高原地区不可或缺的生活和经济来源，这也使牦牛成为当地畜牧业经济中起到支柱性作用的重要畜种。但是，由于牦牛所生活的环境多处于高原地区，自然条件特殊，环境恶劣，再加上牧区牧民的饲养管理技术较为落后以及病原性等因素的影响，使得犊牦牛腹泻发病率很高，这已成为导致犊牦牛死亡最常见的病因之一。后焕文等[7]调查表明，甘南犊牦牛腹泻平均发病率为17.57%，平均病死率则高达44.91%，这已经使当地牦牛业的健康发展受到了严重危害。因此，了解初生牦牛小肠的早期形态结构及sIgA黏膜免疫效应细胞的分布特征，对采取有效的措施加强初生牦牛的饲养管理、减少犊牦牛腹泻疾病的发生从而降低发病率和病死率，最终对提高犊牦牛成活率具有重要意义。

综上，sIgA细胞在初生犊牦牛小肠中的分布规律，目前还未见相关报道。因此，本研究选取初生牦牛为研究对象，研究其小肠黏膜组织结构及sIgA细胞的分布规律，以期为犊牛消化道疾病的预防、治疗及疫苗的开发等方面提供重要的免疫学理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究总共选取5例健康的1～7日龄犊牦牛作为研究对象，待牦牛颈动脉放血处死之后，再剖开腹腔，自幽门后1 cm至盲肠口前0.5 cm整段截取，完整取出其十二指肠、空肠、回肠，接着再使用生理盐水将采集的样本都彻底冲洗干净。之后，将每个肠段都划分为5份，分别固定在40 g/L中性多聚甲醛溶液中，同时，对每一个肠段都做好标记。小肠组织样全部采集自甘肃省甘南藏族自治州合作屠宰场，

SP试剂盒、DAB染色试剂盒、家兔抗IgA多克隆抗体（rabbit polyclonal to IgA）以及载玻片盖玻片等均向某生物技术有限公司采购。

1.2 组织学切片染色观察

对采集回来的小肠组织先进行分段处理，标明十二指肠、空肠、回肠，再对每个肠段组织进行切块，每个组织块约为1cm³，每个肠段各取5个组织块。依次经过脱水、透明、浸蜡后，常规石蜡包埋，待蜡块凝固后作适当修整，确保蜡块的各个边缘都是整齐的，规格大小也都是适宜的，之后将蜡块放置到切片机上做连续切片，切片厚度均为5μm，每例各选取5片，HE染色观察小肠基本结构。

1.3 sIgA细胞分布观察

免疫组织化学染色使用家兔抗IgA多克隆抗体，使用时需按照 1/100稀释之后再使用。并且在免疫组织化学的染色时，实际操作流程及步骤应当按照SP试剂盒详细说明书进行。染色时可用0.01 mol/L的PBS缓冲液取代一抗作为空白对照，同时，应用Olympus-DP71显微镜在镜下观察阳性细胞的实际分布情况，并且拍照保存。

2 结果

2.1 初生牦牛小肠组织形态结构

通过组织切片经HE染色观察发现，初生犊牦牛小肠壁层组织共由4层构成，分别包括黏膜层、黏膜下层、肌层以及浆膜层。黏膜层则由3层构成，包括了黏膜上皮、固有层、黏膜肌层。在显微镜下，可以清晰地观察到十二指肠绒毛呈叶状形态，相较于空肠和回肠更为粗短，且排列更为紧密(见图1A)；空肠绒毛为长杆状，细长且排列稀疏（见图1B），回肠绒毛长度较短且排列稀疏，并且还可观察到局部绒毛表面出现类似脑沟回形的皱襞（见图1C）。小肠的绒毛上皮细胞基本上均为单层柱状上皮细胞，并且在上皮细胞之间还散在分布有杯状细胞和淋巴细胞。另外，小肠腺作为小肠组织的代表性结构之一，在十二指肠、空肠、回肠三者的黏膜固有层中均可观察到。并且在十二指肠黏膜下层中可清晰观察到十二指肠腺，空肠黏膜下层除肠腺外还可观察到有少量散在分布的淋巴小结，呈圆形或椭圆形，着色较深。回肠黏膜下层中则可见大量集合淋巴小结。

图1 初生牦牛小肠黏膜结构 HE染色 100×

2.2 初生牦牛小肠sIgA细胞的分布

本研究观察到sIgA细胞在小肠各结构中均有分布，并且在肠绒毛基部固有层中的分布量最多（图2A-C）。不同肠段当中sIgA细胞的分布情况是不相同的，十二指肠上主要分布在绒毛基部固有层以及十二指肠腺附近，空肠中sIgA细胞基本上分布在绒毛固有层之中，回肠当中则是以富含淋巴细胞的绒毛和集合淋巴小结当中为主，此外，在回肠绒毛上皮中也有少量分布。

图2 初生牦牛小肠IgA+细胞的免疫组织化学反应 1000×

3 讨论

本研究所得结果表明，初生牦牛小肠管腔组织结构从内到外共由4层构成，分别依次为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜组成。黏膜层的基本构成又可分为3层，包括了黏膜上皮、固有层以及黏膜肌层。为了增加机体对于营养物质的有效吸收，小肠黏膜层内的固有膜会向管腔内突起形成连续的褶皱，并且在其表面覆盖了上皮细胞从而形成了肠绒毛，同时在显微镜下还可清楚观察到肌层有内侧环形肌和外侧纵形肌两层。在小肠的黏膜固有层中均有小肠腺分布其中，这是小肠的代表性结构之一。十二指肠腺紧密排列在十二指肠的黏膜下层中，空肠黏膜下层偶尔可见散在分布的淋巴小结，回肠黏膜下层中则可见大量集合淋巴小结，这些研究结果和常兰等人[2]针对藏羚羊和藏绵羊的小肠结构所进行的研究结果是一致的，表明初生牦牛小肠结构完整，已具备一定的消化吸收能力。

黏膜免疫系统属于动物免疫系统当中最重要的构成部分之一，此系统会分泌大量sIgA，sIgA则会和病原微生物抗原结合形成抗原抗体复合物。此外，其还能够刺激消化道黏膜中的杯状细胞，促使杯状细胞分泌大量黏液，从而可以有效抵御并清除动物体内的各种寄生虫[8]。根据本研究结果可知，sIgA细胞在初生牦牛十二指肠、空肠、回肠上主要分布于黏膜固有层，而在肠绒毛上的分布量较少。这个结果与杨倩等人的研究结果也相符合[9]。笔者分析sIgA细胞在小肠中这样分布的原因可能与固有层结构疏松，从而更有利于其分泌并转移的IgA向周围扩散，进而可以达到更好的局部免疫效果有关。不同肠组织当中sIgA细胞的分布情况是不相同的，十二指肠上主要分布在绒毛基部固有层以及十二指肠腺附近，空肠中sIgA细胞基本上分布在绒毛固有层之中，回肠当中则是以富含淋巴细胞的绒毛和集合淋巴小结当中为主，此外，在回肠绒毛上皮中也有少量分布，本结果和车传燕等研究结果也相符合[4]。小肠黏膜sIgA细胞无论是十二指肠、空肠还是回肠，都主要分布在肠绒毛基部的肠腺周围，但是有一点需要注意，那就是肠绒毛下的 sIgA细胞局部密度是明显低于肠腺周围密度的，这样就可以说明肠腺很可能就是sIgA进入肠腔的主要途径，这可能为动物机体小肠不同部位发挥不同程度的免疫功能提供了重要的理论基础。