食品中沙门氏菌的测定

练晓娟，宋勇强，仝伟建，杨晓楠，何建红

（兰州国信环境能源科技有限责任公司，甘肃 兰州 730050）

沙门氏菌（Salmonella）是一类广泛存在于自然界中的无芽孢、无荚膜、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌[1]。沙门氏菌的最适生长温度为35～37℃，菌对外界环境有一定的抵抗力，在动物性食品中可存活数周至数月，在粪便中可存活数月，在盐分为 5%～8%的环境下，也可存活超过30 d[2]。

沙门氏菌是一种常见的人畜共患的食源性致病菌，主要在人类和动物肠道中寄生。当沙门氏菌菌体溶解时，细胞壁能够释放出脂多糖，从而形成内毒素[3]。感染沙门氏菌可致慢性咽炎、肠热症、食物中毒等。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。每年超过3 000万人感染沙门氏菌，引起20多万人死亡[4]。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。沙门氏菌分型较多，而且具有较高的致病性，为致病菌的一种[5-10]。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。其中由伤寒、副伤寒沙门氏菌引起的急性全身系统性传染病是我国《传染病防治法》中规定报道的乙类传染病[11]。目前全球已知的沙门氏菌属，有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病的。并且能够在短时间内大量繁殖。伤寒、急性肠胃炎、菌血症和败血症等疾病皆是由沙门氏菌感染所引起的[12]。因此，食品中沙门氏菌的检测也成了食品安全检测中至关重要的一项。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品 兰州市市售不同品牌的火腿肠11份，编号A～K。

1.1.2 标准菌株 阳性对照菌株-鼠伤寒沙门氏菌FSCC215013（ATCC14028）购于广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.3 培养基与试剂

1.1.3.1 培养基

营养琼脂：蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸膏3.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、琼脂15.0 g/L，121℃灭菌15 min，购于北京路桥技术股份有限公司；

缓冲蛋白胨水（BPW）：蛋白胨10.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、磷酸氢二钠（12H2O）9.0 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L，121℃灭菌15 min，购于北京路桥技术股份有限公司；

四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液基础：蛋白胨9.0 g/L、牛肉粉4.5 g/L、氯化钠2.7 g/L、碳酸钙40.5 g/L、牛胆盐5.0 g/L、硫代硫酸钠（含5个结晶水）50.0 g/L，121℃灭菌20 min，购于北京路桥技术股份有限公司；

亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：蛋白胨5.0 g/L、乳糖4.0 g/L、磷酸氢二纳10.0 g/L、亚硒酸氢钠4.0 g/L、L-胱氨酸0.01 g/L，加热煮沸灭菌，购于北京路桥技术股份有限公司；

亚硫酸铋（BS）琼脂：蛋白胨10.0 g/L、亚硫酸钠6.0 g/L、牛肉粉5.0 g/L、煌绿0.025 g/L、葡萄糖5.0 g/L、柠檬酸铋铵2.0 g/L、磷酸氢二钠4.0 g/L、琼脂18.0 g/L、硫酸亚铁0.3 g/L，加热煮沸灭菌，购于北京路桥技术股份有限公司；

木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：酵母膏3.0 g/L、酚红0.08 g/L、L-赖氨酸5.0 g/L；硫代硫酸钠6.8 g/L、木糖3.75 g/L、柠檬酸铁铵0.8 g/L、乳糖7.5 g/L、去氧胆酸钠2.5 g/L、蔗糖7.5 g/L、琼脂15.0 g/L、氯化钠5.0 g/L，加热煮沸灭菌，购于北京路桥技术股份有限公司；

三糖铁（TSI）琼脂：蛋白胨20.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、葡萄糖1.0 g/L、蔗糖10.0 g/L、牛肉粉5.0 g/L、硫代硫酸钠0.2 g/L、酚红0.025 g/L、乳糖10.0 g/L、硫酸亚铁铵（6H2O）0.2 g/L、琼脂12.0 g/L，分装后115℃灭菌15min，购于北京路桥技术股份有限公司。

1.1.3.2 试剂

氯化钠，北京路桥技术股份有限公司；P-72碘液，北京路桥技术股份有限公司；P-73 0.1%煌绿，北京路桥技术股份有限公司；0.5%麦氏比浊液，北京路桥技术股份有限公司；沙门氏菌生化鉴定试剂盒，北京路桥技术股份有限公司。

1.1.4 仪器与设备 BSA822电子天平（百分之一），赛多利斯（上海）贸易有限公司；GR85DA高压灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；DHP-9272电热恒温培养箱，上海齐欣科学有限公司；HR40-IIA2生物安全柜，青岛海尔特种电器有限公司；HCB-1300V超净工作台，青岛海尔特种电器有限公司；移液器，普兰德（上海）贸易有限公司；FE28-Standard酸度计（pH计），瑞士梅特勒-托利多。

1.2 方法

1.2.1 方法选择 依照国家标准《GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》提供的方法进行检测。

1.2.2 样品采集 随机采购兰州市市售不同品牌火腿肠11份。

1.2.3 预增菌 无菌操作称取25 g样品，置于盛有225 ml BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2 min。用1 mol/ml无菌NaOH或HCL调pH至6.8±0.2，于36 ℃±1 ℃培养8～18 h。

1.2.4 增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 ml，转种于10 ml TTB内，另取1 ml，转种于10 ml SC内，同时于阳性对照间接种沙门氏菌标准菌株阳性对照，TTB增菌液于42 ℃±1℃培养18～24 h，增菌液于36 ℃±1 ℃培养18～24 h。

1.2.5 分离 分别用直径3 mm的接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS平板和一个XLD平板，同时于阳性对照间接种沙门氏菌标准菌株阳性对照，BS琼脂平板于36 ℃±1 ℃培养40～48 h，XLD琼脂平板于36 ℃±1℃培养18～24 h，观察各个平板上生长的菌落。

1.2.6 三糖铁试验 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种营养琼脂平板，同时于阳性对照间接种沙门氏菌标准菌株阳性对照，于36 ℃±1 ℃培养18～24 h，观察三糖铁琼脂及营养琼脂平板上生长的菌落。

1.2.7 沙门氏菌生化鉴定试剂盒鉴定 从铝箔袋中取出试剂盒，打开盒盖，在试剂盒的长条槽中加入1.0 ml无菌生理盐水，防止培养过程中菌悬液干燥。从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，仔细研磨，与标准0.5麦氏浊度比浊管进行比较，制成0.5麦氏浊度的菌悬液，同时于阳性对照间接种沙门氏菌标准菌株阳性对照。

使用无菌移液器吸取制备好的0.5麦氏浊度的菌悬液，分别至试剂盒的9个圆孔中，每孔接种量为0.2 ml，盖上盒盖，于36 ℃±1 ℃培养24 h，氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、氰化钾对照、氰化钾接种后需加入2～3滴无菌液体石蜡覆盖培养基表面；靛基质培养后观察结果时需滴加2～3滴靛基质试剂，即刻观察结果。

2 结果

2.1 增菌

如图1所示，经增菌培养18～24 h后，TTB增菌液中，阳性对照试验管由深绿色变为浅绿色，样品及空白对照不变色；SC增菌液中，阳性对照试验管由黄色变为橙色，样品及空白对照不变色。

图1 沙门氏菌TTB增菌（左）及SC增菌（右）培养

2.2 分离

如图2所示，增菌液接种BS琼脂后，经培养48 h，阳性对照在平板上生长出黑色有金属光泽、棕褐色或灰色的菌落，菌落周围培养基呈黑色或棕色，样品及空白对照无菌落生长。

图2 BS琼脂平板上的菌落形态

图3 XLD琼脂平板上的菌落形态

如图3所示，增菌液接种XLD琼脂后，经培养24 h，阳性对照在平板上生长出粉红色、带或不带黑色中心的菌落；大的带光泽的黑色中心，全黑色的菌落。样品及空白对照无菌落生长。

2.3 三糖铁试验

如图4所示，自选择性琼脂平板上挑取的可疑菌落接种三糖铁琼脂，经培养24 h后，阳性对照在三糖铁琼脂斜面上，上层斜面产碱变红，底层产酸变黄，产生硫化氢变黑，不产气，样品及空白对照无变化。

图4 三糖铁试验结果

如图5所示，自选择性琼脂平板上挑取的可疑菌落接种营养琼脂，经培养24 h后，阳性对照在营养琼脂平板上生长出白色、圆形、表面光滑、湿润、半透明的菌落，样品及空白对照无菌落生长。

图5 营养琼脂平板上的菌落形态

2.4 沙门氏菌生化鉴定

如图6所示，阳性对照三糖铁琼脂斜面有硫化氢产生，靛基质无变化，尿素无变化，氰化钾无变化，赖氨酸脱羧酶由黄色变为紫色，对照沙门氏菌生化反应鉴定表可知，为典型沙门氏菌属反应；样品及空白对照无变化。

图6 沙门氏菌生化鉴定

3 讨论

3.1 检测样品的污染情况

本次调查从兰州市市售不同品牌的火腿肠中进行随机抽样检测，共采样11份，编号A～K，通过一系列增菌、分离纯化及斜面培养后，根据菌株在平板以及斜面培养基上的菌落特征，与阳性对照菌株进行对照，结合沙门氏菌生理生化试验结果，确定了11份样品均未受到沙门氏菌污染。

3.2 沙门氏菌的现有检测方法的局限及未来展望

近年来，随着人畜感染沙门氏菌病例增多，食品中沙门氏菌的检测已经成为不可或缺的一环。而传统国标的沙门氏菌检测方法虽然可以对沙门氏菌进行检测，但也有检测时间过长、检测步骤繁琐等缺点。随着生物技术的发展，沙门氏菌的检测技术也在不断地发展进步，许多快速检测方法开始应用于沙门氏菌的检测，且48 h内就可检出沙门氏菌。直到现在，已经在应用中的方法有免疫学方法（包括酶联免疫吸附法、斑点酶联免疫吸附、斑点免疫金渗滤法、免疫磁性分离技术、免疫荧光标记、自动酶标免疫检测仪、葡萄球菌A蛋白协凝试验法等）、分子生物学方法（包括聚合酶链反应（PCR）技术、核酸探针、扩增片段长度多态性技术、基因芯片技术、环介导等温扩增方法、荧光定量PCR、噬菌体裂解试验、原位荧光 LAMP 技术等）等[13]。但新技术的应用也有其局限性，免疫学方法检测沙门氏菌经济、高效、易于操作，但是灵敏度偏低。分子生物学方法检测沙门菌具有快速、灵敏度高、特异性强等优势，但对仪器设备、试剂要求高，费用昂贵无法普及[14]。因此，目前沙门氏菌的检测还不能完全脱离传统方法，达到高效准确检测出沙门氏菌的效果，开发出高效、快速、低成本、灵敏度高的沙门氏菌检测方法仍是未来的研究方向。