茶中多酚类化合物抗流感病毒的研究进展

易 娟，刘 淼

（1.长沙卫生职业学院，长沙 410000；2.湖南省科学技术信息研究所，长沙 410001）

流感是一个严重的公共卫生问题，具有传播快、发病率高、流行广泛、病毒易产生变异等特点，其疫苗效用有限且供应不足［1］。金刚烷胺类药和神经氨酸酶抑制剂（如奥司他韦）等抗流感病毒药物的耐药性已被证实［2］。因此，迫切需要开发具有不同作用机制的抗病毒药物。

茶中多酚类化合物是一类以儿茶素为主体的具生物氧化作用的酚性化合物，儿茶素约占多酚化合物的60%～80%［3］。茶多酚在抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗肥胖及防治心脑血管疾病等方面具有积极作用。近年来研究发现，儿茶素及其衍生物具有对抗多种病毒的作用，包括艾滋病毒［4］、寨卡病毒［5］、乙型肝炎病毒［6］、丙型肝炎病毒［7-8］、孔肯雅病毒［9］、单纯疱疹病毒［10］、流感病毒［11-13］等，被认为是一种潜在的抗病毒先导体。儿茶素由儿茶素单体组成，包括儿茶素（catechin，C）、表儿茶素（epicatechin，EC）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、儿茶素没食子酸酯（catechin gallate，CG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）及表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）等。其中EGCG占儿茶素总量的70%～80%，因其化学结构（图1）与几个酚羟基连接，易氧化生成氢离子，在中性和碱性条件下不稳定，故具有很强的抗氧化作用［14］。EGCG是二十余年来茶中多酚类化合物活性研究中使用最多、最受关注的成分，对包括流感病毒在内的几种包膜病毒具有广泛的抗病毒活性［11-13］。茶黄素是EGCG和其他儿茶素单体在红茶、普洱熟茶发酵工艺中形成的衍生物，与EGCG相比，它在一些研究中似乎表现出更强的抗病毒活性［15］。本文对近二十年来国内外茶多酚类化合物如儿茶素及其衍生物的抗流感病毒作用、作用机制、临床研究以及应用开发等方面进行了综述与分析。

图1 EGCG的化学结构Fig.1 Chemical structure of EGCG

1 茶中多酚类化合物抗流感病毒作用

在茶抗病毒研究中，大多数研究集中在儿茶素单体，特别是EGCG，体内外试验都发现绿茶中富含的EGCG 在抗流感中发挥重要作用［16-19］。Song等［16］通过体外试验研究了绿茶中3个儿茶素单体对流感病毒的影响，发现EGCG和ECG均表现出抑制血凝素的活性，但EGCG的活性更强。EGCG和ECG对神经氨酸酶活性的抑制作用比EGC强，可能是儿茶素骨架的3-没食子酸基对抗病毒活性起着重要作用，而2位三羟基苄基部分的5'-OH起着次要作用。黄深惠等［17］对比了7种茶多酚物质，体外试验发现EGCG和ECG对3种流感病毒（H5N1、H1N1和H9N2）感染后的细胞有显著保护作用，而GC、EC、EGC等其他5种作用较弱，可能与这5种茶多酚物质没有没食子酸结构有关。这些对比研究显示，在成分繁多而复杂的茶中多酚类化合物中，儿茶素中的酯型儿茶素EGCG和ECG可能是最具研究价值的成分。动物试验显示，口服 EGCG［40 mg/（kg·d）］可显著提高感染流感病毒的BALB/c小鼠的存活率，降低小鼠体内的平均病毒滴度，并缓解致死性流感病毒感染导致的病毒性肺炎病理损伤，作用相当于口服阳性对照药物奥司他韦［40 mg/（kg·d）］［18］。肖潇等［19］也证实了 EGCG 能提高流感病毒感染小鼠的存活率，延长生存时间，并缓解流感导致的肺病理损伤。

经化学修饰后的儿茶素衍生物能更好地发挥抗流感的作用，如引入酮基、酰基化或改变烷链长度等能提高膜通透性或提高化学稳定性［20-24］。EGCG的简单类似物双脱氧EGCG对甲型流感病毒（H3N2）的抑制作用为EGCG的4倍［20］。在EGCG中添加长酰基链（C16-18）可将其抗流感病毒活性提高44倍，酰基化还提高了EGCG的化学稳定性［22］。采用脂肪酶催化酯交换反应合成的一系列EGCG O-酰基衍生物表现出比EGCG高几倍的活性，在EGCG中加入长链烷基可显著增强其对多种细菌和真菌的活性［23］。2018年，Kaihatsu等［24］提出了一种新的EGCG脂肪酸衍生物——EGCG脂肪酸单酯，其中酚羟基上的脂肪酸有望增加病毒和细胞膜的通透性，对不同类型的病毒具有更好的抗病毒活性。根据儿茶素衍生物的结构与抗病毒活性的关系，儿茶素衍生物的3-没食子酸和5'-OH基团对其抗病毒活性起着关键作用，增强EGCG与病毒颗粒的结合亲和力对提高杀病毒活性至关重要。以上这些研究都为EGCG等儿茶素在病毒感染防治中的应用开拓了新思路。

茶中多酚类物质在发酵过程中转化为茶红素、茶黄素和茶褐素等高聚化合物。茶黄素（其化学结构见图2）及其衍生物是红茶中的主要成分，目前茶黄素（theaflavin，TF1）、茶黄素-3-没食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF2A）、茶黄素-3'-没食子酸酯（theaflavin-3'-gallate，TF2B）、茶黄素-3，3'-双没食子酸酯（theaflavin-3，3'-digallate，TF3）是最主要的茶黄素类化合物［25］。早期体内外试验发现红茶提取物、茶黄素单体TF3可抑制流感病毒［26-28］，并且被灭活的流感病毒在体内不会发生逆转［27］。近年来，Zu等［29-30］的动物试验证实来自红茶的茶黄素（TF纯度为80%）以及3种茶黄素衍生物（theaflavins，TFs）对3种不同的流感病株［A/PR/8/34（H1N1）、A/Sydney/5/97（H3N2）和 B/Jiangsu/10/2003］有抑制作用；李湘潋等［31］也证实茶黄素衍生物混合物（TF1、TF2A、TF2B、TF3 总质量分数＞85%）能明显抑制 H5N1泰国株的假病毒。2014年，Yang等［15］对比研究了茶黄素、原花青素B-2、EGCG、EGC等茶中多酚物质抗病毒作用，发现茶黄素和原花青素等二聚体比EGCG等单体表现出更强的抗流感病毒活性，二聚体分子的茶黄素可能是抗流感病毒的重要化合物。尽管已有研究发现茶黄素比EGCG抗病毒作用更强，但需要更多体内外试验和相关机制来验证。

图2 茶黄素的化学结构Fig.2 Chemical structure of theaflavin

近年来开始受到科学家关注的消脂素是普洱茶中主要多酚成分的水解型鞣酸单宁，也具有抗流感病毒的作用［32-33］，可能是一种有效的抗病毒物质。此外，研究发现茶多酚与其他物质如抗坏血酸等联合使用，能起到协调抗病毒的作用［34-35］。

2 茶中多酚类化合物抗流感病毒作用机制

2.1 抑制流感病毒对宿主细胞的吸附

流感病毒表面的糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）与宿主细胞表面的唾液酸受体特异性结合后，病毒吸附于细胞表面并被细胞膜包裹，以胞吞的方式进入细胞。茶中多酚类化合物的抗流感效应有可能是通过干扰病毒膜蛋白，作用于吸附、进入和膜融合等步骤来抑制早期感染。最早Nakayama 等［26］认为红茶提取物可抑制病毒附着于细胞，而不是抑制病毒在细胞中的复制。随后他们又发现EGCG和TF3能有效阻止流感病毒在犬肾（Madin-Darby canine kidney，MDCK）细胞上的黏附，它们可与流感病毒的血凝素结合，抑制病毒对宿主细胞的附着，阻断病毒在细胞内的复制［27］。2005年，Song等［16］发现 EGCG和ECG表现出抑制血凝的活性，且EGCG更为有效；它们对3种不同亚型流感病毒的血凝抑制敏感性差异很大，而且其对流感病毒的抑制作用不仅是由于儿茶素可与血凝素的特异性相互作用，而且还可以改变病毒包膜的物理性质。Colpitts等［36］将甲型流感病毒H1N1和H3N2病毒株暴露于100μmol/L EGCG或100μmol/L EC中，测试处理过的病毒粒子对鸡红细胞的血凝能力，发现EGCG抑制了所有4种病毒株的血凝反应，而EC无明显作用。同时研究表明EGCG能与唾液酸竞争结合甲型流感病毒表面糖蛋白，从而抑制血凝反应，抑制病毒体附着。然而与前面的研究不同之处是，它不影响病毒粒子包膜的完整性或流动性。2012年，Liu等［37］报道了4种儿茶素单体对H5N1流感病毒血凝素的抑制作用强弱依次为EGCG＞ECG＞EGC＞EC。通过研究分子结构，他们认为没食子酸基团和C5位上的羟基可能是抑制HA的主要原因。

HA蛋白前体（HA0）分子水解为HA1和HA2，是流感病毒感染性的先决条件。Kim 等［38］发现1μmol/L EGCG即可干扰HA0和HA2蛋白分泌，指出EGCG阻断了流感病毒生命周期的早期步骤。EGCG通过降低病毒包膜的完整性来抑制病毒包膜与细胞膜之间的融合，从而导致流感病毒进入细胞的能力丧失。茶黄素衍生物混合物对病毒血凝素活性的抑制，可能是与病毒血凝素HA2亚基结合而不与HA1亚基结合［30-31］。此外，Zu等［30］通过定量聚合酶链锁反应测定发现TF衍生物能抑制病毒HA基因的复制。

2.2 影响流感病毒在宿主细胞的复制

神经氨酸酶（neuraminidase，NA）又称唾液酸酶，是分布于流感病毒包膜上的一种糖蛋白，可以催化唾液酸水解，协助成熟流感病毒脱离宿主细胞去感染新的细胞，是病毒复制和扩散的关键酶。NA抑制剂是抗流感病毒重要药物［39］。研究显示茶中多酚类物质对 NA 有抑制作用［16，39-40］。2005 年，Song等［16］发现EGCG和ECG是MDCK细胞培养中流感病毒复制的有效抑制剂，在所有检测的流感病毒亚型（包括A/H1N1、A/H3N2和B型流感病毒）中都观察到这种作用，与EGC相比，EGCG和ECG对神经氨酸酶活性的抑制作用更强。黄深惠等［17］也证实EGCG、ECG等7种茶多酚物质对3种亚型流感病毒NA活性均有抑制作用，茶黄素衍生物混合物也能抑制NA活性［29-30］。2016年，Sahoo等［40］利用H1N1-NA的氨基酸序列预测三级结构，发现在13种被测的不同植物提取物中，绿茶提取物等都对H1N1-NA的结合有抑制作用，这与它们和NA蛋白的氨基残基相互作用有关。2015年，Müller 等［41］发现儿茶素与流感神经氨酸酶的结合位点可能是在第430位氨基酸邻近的结构保守腔（被认为是第二个唾液酸结合位点），因此儿茶素可能通过抑制NA活性部位与唾液酸结合而抑制病毒从宿主细胞释放。

流感病毒的RNA聚合酶在病毒生命周期中行使病毒基因组的转录与复制等功能。由于流感病毒频繁变异，导致其对传统抗病毒药物的敏感度降低。开发疗效好、针对性强、毒性低的新型抗病毒药物已成为当今研究的一个热点［42］。甲型流感RNA聚合酶具有内切酶活性以消化宿主mRNA，因此，该核酸内切酶结构域可作为抗甲型流感病毒药物的靶点。Song等［16］报道了定量逆转录聚合酶链反应，结果显示600μmol/L高浓度的EGCG和1 200μmol/L高浓度的ECG导致病毒RNA合成下调，他们认为流感病毒产生量减少不是儿茶素的细胞毒作用，而是儿茶素具有抑制流感病毒RNA合成的能力。据报道，绿茶儿茶素抑制甲型流感病毒核酸内切酶的活性，对接模拟表明没食子酸与没食子酸基团的儿茶素能很好地结合到核酸内切酶活动区的活性囊中，从而实现稳定的结合［43］。核酸内切酶除参与核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解外，还可识别外源DNA并将其降解，就生理意义而言，这是一种自身防御能力的体现。甲型流感病毒的核酸内切酶活性在茶中儿茶素的干预下受到抑制，其功能即被抑制。

2.3 茶中多酚类化合物的抗氧化作用对流感病毒的影响

据报道，绿茶提取物不仅抑制甲型和乙型流感病毒在MDCK细胞的生长，在活体荧光显微镜下可见，其对宿主细胞溶酶体的酸化有浓度依赖抑制作用［44］。溶酶体是细胞浆内单层脂蛋白膜包绕、内含一系列酸性水解酶的小体，具有细胞自噬功能，其活性失调可导致细胞器活动异常，如产生过量反应氧化产物等。绿茶提取物，尤其是绿茶中的儿茶素，是公认的天然抗氧化剂，在茶提取物抗流感病毒研究中，它的强抗氧化性是否具有积极作用也成为研究者们的研究目标。

2012 年，卫飞等［45］报道EGCG作用于被甲型H1N1流感病毒感染的宿主细胞后，宿主细胞氧化应激水平显著增强，显著降低了细胞内活性氧及超氧化物阴离子水平，这表明EGCG抗氧化作用在抗流感病毒病理损伤中起重要作用。此外EGCG还可通过抑制流感病毒所致的宿主细胞自噬，发挥抗病毒作用。2018年，Lee等［46］研究发现绿茶提取物的抗病毒活性是由儿茶素与病毒蛋白的氧化交联和改变病毒膜物理性质介导的。Zu等［30］还发现茶黄素衍生物还可降低病毒感染过程中白细胞介素-6（interleukin- 6，IL-6）的表达，其抗炎特性可缓解组织损伤和细胞凋亡。在流感病毒复制周期，宿主细胞氧化应激和自噬所导致的氧化还原环境失衡，从另一个方向解释了茶中多酚化合物抑制流感病毒活性的机理。儿茶素及其衍生物的强氧化作用，降低了受感染细胞内的活性氧及超氧化物阴离子水平，而双脱氢的儿茶素衍生物茶黄素可能进一步提升了EGCG的抑制效果，它有可能与目前批准上市的抗流感病毒药物联合使用，成为更有效的抗流感病毒药物［20-21］。

3 茶中多酚类化合物抗流感病毒的流行病学调查及临床研究

3.1 直接饮用绿茶抗流感的调查研究

Park等［47］报道了学龄儿童饮用绿茶与流感感染发生率的观察研究，在流感季节（2008年11月至2009年2月季节性甲型流感）对日本静冈（茶园区）2 663名年龄为6～13岁学生进行了2次饮茶与流感发病情况的问卷调查，从回收的2 050份调查结果发现，每天饮用1～5杯（1 000～6 200 mL）绿茶与流感感染呈负相关，显示饮用绿茶有可能预防流感感染。

3.2 含EGCG的茶胶囊制剂的抗病毒试验

Rowe等［48］对比观察茶胶囊组（含EGCG和茶氨酸，相当于10杯绿茶）53名受试者和安慰剂组（不含茶成分）55名受试者，结果显示茶胶囊组出现感冒症状和流感症状人数比安慰剂组少32.1%（P=0.035）。然而，该研究未将普通感冒和流感病毒感染者分开进行统计分析，也未进行流感抗原检测，所以无法评价该营养补充剂对预防流感的作用。但该项研究有一个意外发现，作者分离了志愿参与者的外周血单个核细胞，发现服用茶胶囊3周可促进T细胞分泌γ-干扰素，这表明服用EGCG和茶氨酸有可能增强人体免疫功能（γδT细胞功能），达到预防普通感冒和流感的目的。

另一项随机对照研究［49］使用绿茶胶囊（EGCG 378 mg/d、茶氨酸210 mg/d）进行人群干预，根据临床症状和快速抗原检测结果来确认流感患者，发现绿茶胶囊组有患者4例（4.1%）、安慰剂组有13例（13.1%），这表明服用绿茶胶囊组的临床流感感染率明显降低［28］。

3.3 用茶或茶提取物含漱抗病毒试验

在一项前瞻性队列研究中，对151名有红茶含漱习惯的健康参与者和164名无红茶含漱习惯的健康参与者进行5个月随访，根据抗体滴度检测，发现含漱红茶组健康参与者流感患病率为35.1%，无含漱红茶组健康参与者流感患病率为48.8%，两者存在显著性差异（P＜0.050）［29］。另一项研究用快速抗原法检测了124名疗养院研究对象，3个月后，发现绿茶提取物含漱组的流感感染率明显低于水含漱组流感感染率（P=0.028）［50］。

2016 年，Ide等［51］对日本5项茶或茶提取物漱口人群研究进行了Meta分析，受试者年龄跨度从16岁到83岁，受试人数合计1 890人，综合分析发现，用红茶或绿茶及含EGCG的绿茶提取物漱口显著降低了流感感染风险，说明用茶或茶成分漱口可能有预防流感的作用。

现有的临床研究均是将绿茶或红茶提取物作为营养补充剂或卫生用品，以评估预防流感的潜在作用，研究存在诸多局限性，如样品数量偏少、研究对象均在日本等，还需要设计更严谨的大样本临床观察作为依据，以证明茶提取物漱口具有预防流感的作用。

4 茶中多酚类化合物抗流感病毒产品的应用研究

利用茶多酚的抗流感病毒作用，还可将其做成混合制剂，用作洗手液、喷雾剂、粉末或溶液等抗流感病毒产品［46，52-53］，或者用于抗流感疫苗佐剂等的研发［54-55］。2012 年，Shin等［52］应用流感病毒皮肤接触传播试验模型评估绿茶提取物作为手消毒剂使用情况，发现其能清除皮肤表面的病毒。2018年，Lee等［46］发现绿茶提取物溶液或粉末中添加2%柠檬酸、0.1%苯甲酸钠和0.2%抗坏血酸作为抗氧化剂，能显示较强的病毒灭活能力并延长储存时间至2个月之久，其研究结果表明基于绿茶提取物的物质可成为安全环保的抗病毒个人卫生用品。Lee等［53］的另一项研究发现，绿茶提取物中的天然儿茶素可作为灭活剂制备灭活病毒疫苗，其对流感病毒和登革热病毒的灭活作用是完全的和不可逆的。接种绿茶提取物灭活的流感病毒疫苗，其诱导的抗体反应优于福尔马林等传统的灭活疫苗。Won等［54］发现绿茶提取物能增强流感病毒裂解疫苗对黏膜免疫的影响。除了绿茶提取物外，刘洪卿等［55］发现普洱茶提取物能明显提高H3N2流感病毒无佐剂疫苗的抗体效价，且具有良好的安全性，可作为疫苗佐剂，但究竟是普洱茶中何种成分在发挥免疫增强作用仍有待研究。

5 总结与展望

对茶中儿茶素及其衍生物的潜在抗流感病毒作用研究起步于二十多年前，经历了科学探索的一个普遍过程，即由简到繁、由宏观至微观。体内外研究揭示了儿茶素及其衍生物抗流感病毒的可能机制，包括抑制流感病毒在宿主细胞的附着、抑制流感病毒在宿主细胞的复制（可能与抑制一些酶的活性有关，如神经氨酸酶和核酸内切酶等）以及通过抗氧化作用调控氧化应激抑制细胞凋亡等。此外，几项关于使用茶及其成分含漱的前瞻性队列及随机对照的人群试验显示出茶及其多酚化合物预防流感感染的效果［29，50-51］。茶中多酚类化合物作为一种潜在的广谱抗病毒化合物，有可能成为抗流感病毒药物的前体，或者抗流感病毒的营养补充剂、个人卫生用品等。然而，该研究还处于开拓性阶段，目前对茶中多酚类化合物的药效学、药动学以及安全性研究关注较少，临床研究也有局限性。

二十余年来茶中多酚类化合物抗流感病毒的研究发现了茶黄素及其衍生物可能具有较绿茶儿茶素更强的抗流感病毒的作用。由于这些文献对试验材料茶黄素的定义各自不同（红茶水、茶黄素、TF1、TF3等）导致无法准确确定究竟是哪种化合物，试验材料定性不清楚，对研究结果的判定是有影响的。茶黄素是红茶、普洱熟茶中的一个成分，是茶鲜叶或绿茶在发酵过程中的初级氧化产物，这种衍生物是否比儿茶素单体具有更强的抗病毒作用呢？有研究提示，云南普洱熟茶中的儿茶素衍生物或聚合而成的高分子量化合物，其清除活性氧自由基的能力比儿茶素EGCG强［56-57］。儿茶素衍生物的生物活性为研究者们提供了一个很有价值的思路。