柑橘果胶高效提取及其酰胺化改性制备

苏东林 李培骏 张丽萍 袁洪燕 朱玲风 谢秋涛 潘蒋娟 刘 伟 朱向荣，5 张菊华 李高阳，5 单 杨*

（1 湖南省农业科学院 湖南省农产品加工研究所 长沙410125 2 中南大学研究生院隆平分院 长沙410125 3 桂林理工大学化学与生物工程学院 广西桂林541004 4 果蔬加工与质量安全国际联合实验室 长沙410125 5 果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室 长沙410125）

果胶是一种无毒且具有卓越的凝胶性和乳化稳定性的天然食品添加剂，相关研究表明，作为可溶性膳食纤维，果胶具有抗腹泻、抗癌、治疗糖尿病等功效，应用范围正不断扩大；此外，果胶在各种反应机制及新陈代谢途径中都有显著效果，已成为一些药物、保健品和化妆品中不可缺少的辅料[1-6]。据联合国联农组织（FAO）统计，全球果胶年需求量达7 万余t（市场缺口1.2 万余t），在较长时间内仍将以每年5%～10%的速度增长。目前我国每年消费果胶4 000 t 以上，其中80%依赖进口，需求量与世界平均水平相比呈高速增长趋势。当前商品果胶的原料主要是柑橘皮、柠檬皮和苹果渣，而真正具有工业生产价值的天然果胶来源首推柑橘皮；我国柑橘产量居世界第一（2018年达4 138 万t），年产皮渣超过1 300 万t，内含丰富的果胶、香精油和类黄酮等功效成分[4，7-9]。美国食品化学品法典 （Food Chemicals Codex，FCC）规定：DE 值高于50%的果胶称为高酯果胶（High methoxyl pectin，HMP），反之，称为低酯果胶（Low methoxyl pectin，LMP），后者包括酰胺化果胶（Amidated low methoxyl pectin，ALMP）。

传统果胶提取通常使用酸性水或溶剂，排放造成严重的环境污染[10]。为了克服这个问题，已出现几种可持续和更快提取果胶的替代方法，如微波辅助提取法（MAE）[11-12]、亚临界水提取法（SWE）[13]和酶辅助提取法（EAE）[14]。超声辅助提取（UAE）是另一种广泛使用的提取技术，它利用声能和溶剂来增强细胞材料的释放和扩散，从而有助于提取[15-18]。有研究表明，单独超声提取得到的果胶产量通常比传统加热或MAE 方法低[19]。为解决其中的瓶颈问题，通过添加溶剂辅助物进行果胶提取与分离，以提高提取率，例如柠檬酸、乙酸、离子液体和螯合剂[20-23]。近年来，表面活性剂被认为是提取生物活性化合物（例如：多酚和凝集素）的有效添加剂[24-25]。在浓度等于或高于表面活性剂的临界胶束浓度时，复合体系会形成胶束，这些胶束能够与亲水或亲脂物质建立化学和物理相互作用[26]。由于果胶在大范围的极性内具有不同的化学结构，因此可使用合适的表面活性剂进行提取。

果胶酰胺化改性是指将高酯果胶中的部分甲酯转变为伯醇胺而减少甲氧基，一般在碱性条件下通过添加氨水、氨醇体系或者氨气处理来实现。因为氨基基团的进入，ALMP 较普通低酯果胶能在更宽的钙离子浓度范围内形成凝胶，提高水溶性，且作为一般人群食品添加剂无需指定每日摄入量，解决了普通低酯果胶钙离子凝胶范围要求严格（过高的钙敏性），凝胶较弱和易结块等缺点[27-30]。ALMP 的理化性质、功能性质、新型应用及大规模产业化是目前国内外的研究热点、重点和难点[31-38]。

当前，研究用表面活性剂介导的超声辅助（SUAE）提取果胶的方法并不多见，我国对ALMP 工业化大批量连续生产的核心技术和关键设备还未完全自主掌控。本文一方面开展表面活性剂-超声辅助提取（S-UAE）柑橘果胶的工艺研究，另一方面开展后续的酰胺化改性制备优化和品质分析，以期为柑橘副产物的高值化综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

柑橘皮，湖南海联食品有限责任公司（湖南省怀化市），将其在90 ℃的热水中浸泡5 min 以使酶失活，随后置于50 ℃烘箱中空气循环干燥24 h，将干燥的果皮研磨并过40 目筛；随后将预处理的柑橘皮粉末包装在密封袋中，贮存在于干燥的环境中备用。

表面活性剂、盐酸、异丙醇、氨水和无水乙醇等化学试剂均为分析纯级，国药化学试剂有限公司；商品果胶（CP；S11083，从橙皮中提取）和聚半乳糖醛酸，上海源叶生物科技有限公司；单糖标准品，Aladdin Reagents 有限公司。

1.2 主要仪器与设备

KQ-400KDE 型控温超声波清洗仪（300 mm×240 mm×150 mm），昆山超声波仪器有限公司；NICOLET 傅里叶红外光谱分析仪，美国Thermo Fisher Scientific；Agilent 1100 色谱仪及配套设施，美国安捷伦；SU5000 型扫描电子显微镜，日立HITACHI；JEM-2100F 型场发射透射电子显微镜，日本电子JEOL；SHA-BA 数显恒温振荡水浴锅，金坛市富华仪器制造有限公司；LVDV-Ⅱ+PRO型黏度计，美国Brookfield 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 传统酸法提取（CE） 用0.1 mol/L HCl 将提取溶剂的pH 值调节至1.0，将LSR 设定为30 mL/g，并将混合物在90 ℃水浴中加热180 min。提取后，使用8 层纱布（20 目）过滤获得滤液。为除掉剩余的不溶物质，将溶液在4 000 r/min 下离心15 min。上清液加入98%乙醇（1.5∶1，体积比）沉淀并静置6 h，获得果胶。沉淀的果胶在4 000 r/min下离心15 min，并用体积分数60%的乙醇洗涤3次去除可溶性杂质，每个梯度做3 个平行取平均值（文中提取均相同处理）。将提取的果胶放置于50 ℃的干燥箱中烘干12 h 后称重。

1.3.2 S-UAE 法提取 研究表面活性剂吐温-80、吐温-20、聚乙二醇（PEG）4000、PEG8000、蔗糖脂肪酸酯（SE）和十二烷基硫酸钠（SDS）对提取效果的影响，分别将不同质量浓度（0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 g/L）的表面活性剂加入提取溶液中，进行超声提取。预试验获得优化的UAE 参数为：pH 0.6，LSR 21.0 mL/g，功率280 W，时间15 min。

1.3.3 果胶的酰胺化改性 柑橘高酯果胶→过筛、溶解→氨-醇酰胺化→洗涤、干燥→品质分析，研究温度、pH 和果胶质量浓度对产品的酰胺化度、酯化度、特性黏度及平均分子质量的影响。预试验确定氨醇复合体系中氨水浓度3～4 mol/L、异丙醇体积分数50%～60%，反应时间≧100 min（不同时间终止反应可以获得不同类型的酰胺化产品）；在预试验的基础上，以DA 值和黏度为考察指标，开展反应温度、pH 值和果胶质量浓度的单因素试验，寻求适宜的反应参数。

1.4 果胶的理化性质分析

1.4.1 半乳糖醛酸（GA）含量 采用Kumar 的咔唑比色法[39]，并做少许改进。

1.4.2 酰胺化度（DA）、酯化度（DE）和黏度的测定DA 按照黄伟坤[40]的方法测定；DE 按照Jafari等[41]的方法测定，并做少许改进；黏度按照徐铁鹰[42]的方法测定，并做少许改进。

1.4.3 高效尺寸排阻色谱（HPSEC） 通过HPSEC测定目标产物的分子质量分布[43]。

1.4.4 形态学观察 为研究不同的提取方式对柑橘皮造成的影响，以获得柑橘皮渣的形态结构数据，在提取过程前、后拍摄原料的扫描电子显微镜图像：挑选大小合适的颗粒，将其用双面胶粘在循环样品台上，用金属镀膜法，在样品颗粒上镀上一层金属；将样品台放入检测区，在真空条件下，高能电子束将聚成细的电子束聚焦在样品表面上，在其作用下，扫描样品表面，同时将扫描数据转化为图像。该方法特点是使用双面导电碳带将样品粘附到载体上并用金覆盖以确保导电性。

1.5 RSM 和数据分析

RSM 用于确定果胶提取的最佳条件；Box-Behnken 设计（BBD）用于研究3 个独立因素的最佳组合，包括pH 值（X1：0.5～1.5）、超声时间（X2：9～15 min） 和LSR （X3：15～25 mL/g）；Design Expert软件（Version 8.0.6）用于进行响应面试验设计和数据分析；单因素试验采用Origin 处理。试验的水平因子编码具体如表1所示。

表1 Box-Behnkens 试验设计水平因子编码表Table 1 Independent variables and their levels used in the Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 果胶提取

所有变量的RSM 试验结果和预测值如表2所示。

表2 Box-Behnkens 试验结果和预测值Table 2 B-B experimental designs with experimental data and predicted values

表3是方差结果分析（ANOVA），表明线性项和二次项对PY、GA 含量和DE 的影响极其显著（P<0.01）；3 个参数的失拟项不显著，分别是0.6261，0.1108 和0.7255；对应结果表明只有2.76%，0.52%和5.25%的数据不能被该模型解释 （R2分别为0.9724，0.9948，0.9475）。此外，调整后的决定系数值（Adjusted R2）分别为0.9370，0.9880，0.8800，表明模型拟合度高，具有较好的预测能力[44]。

PY，GA 和DE 的二阶方程，见式1～3。

表3 PY，GA 和DE 的ANOVA 分析Table 3 Analysis of variance for PY，GA content and DE of citrus peel pectin

2.1.1 过程变量对果胶PY 的影响 表2显示果胶的提取率在12.7%（No.16，17） 和17.0%（No.5）之间。通过求解方程（1）得到最佳参数是pH 0.6、时间15.0 min 和LSR 21.0 mL/g。在此条件下，根据BBD 试验发现果胶的提取率为17.1%。验证试验获得的最高PY 为（16.9±0.4）%，表明预测值和试验值之间存在高度拟合。方差结果分析和方程（1）表明超声时间对果胶产量影响最大。图1a，1c显示较长的超声时间有利于果胶的提取。在之前的报告中，较长的提取时间有利于溶剂渗透到原料中，溶解秋葵凝乳多糖，然后从原始固体物质中扩散出来[45]。

LSR 和pH 值是影响果胶提取率的另外2 个因素。如图1b，1c 所示，当LSR 从15 mL/g 增加到20 mL/g 时，提取率增加。这可能由于超声波在系统中快速通过，使渗透到植物细胞中的溶剂增加，加速植物材料的破碎从而提高果胶产量[46]。然而，当LSR 值超过20 时，超声波产生的空化作用被破坏，这可能会降低果胶产量[10]。图1a显示当pH 值从1.5 降至0.5 时，果胶产量明显增加。该结果可以解释为提取溶剂的较低pH 直接与不溶性果胶接触，有利于不溶性果胶成分水解成可溶性果胶，从而增加果胶提取率[47]。

2.1.2 过程变量对果胶GA 含量的影响 表2显示GA 含量在76.6%～87.2%之间，表明果胶可以用于食品工业。方差结果分析和方程2 表明pH 值对果胶GA 含量影响最大。

图1 PY（a～c），GA（d～f）和DE（g～i）的响应面和等高线图Fig.1 Effect of process variables of ultrasound-assisted extraction on the PY （a-c），GA content （d-f），and DE （g-i） of citrus peel

图1d和1e 显示较低的pH 值有利于产生具有高GA 含量的果胶，表明这种极端的提取条件（pH<1.0） 有利于不溶性果胶成分水解成可溶性果胶。在较低的pH 值下，提取液中存在更多的H+离子，有利于原果胶的水解[48]。图1e 和1f 表明LSR 是影响果胶GA 含量的另一个变量。本研究中，随着LSR 从15.0 mL/g 增加到21.0 mL/g，GA含量逐渐增加，当超过这个值时，GA 含量会降低，该结果与先前报告一致[44]。

2.1.3 过程变量对果胶DE 的影响 如表2所示，柑橘果胶的DE 从37.0%（No.5）至57.9%（No.17）。方程（3）和图1g～1i 显示3 个变量pH 值、超声时间和LSR 对果胶DE 值的影响逐渐降低；较高的pH 值、较低的超声时间和LSR 有利于产生具有高DE 值的果胶。该结果与先前研究结果一致，研究表明用无机酸提取甜菜果胶的DE 值随着pH 值的增加（从1 到2）而增加[49]。通常，在非常苛刻的提取条件下（如高功率，长时间，低pH值）获得的果胶具有低酯化度，原因在于这些条件可以增加多聚半乳糖醛酸链的脱酯化[50]。

2.1.4 S-UAE 法提取柑橘果胶 本研究中获得最大果胶提取率的优化条件是：超声功率280 W，pH 0.6，时间15.0 min，LSR 21.0 mL/g。为了提高果胶产量，分别在超声提取之前将表面活性剂如吐温-80、吐温-20、PEG 4000、PEG 8000、SE 和SDS加入到提取原料中。从图2可以看出，所有表面活性剂都不同程度提高了果胶产量。

添加吐温-20（6 g/L）和SDS（8 g/L）显著提高了超声作用下的果胶产量。与对照相比，添加这2种表面活性剂后，果胶提取率分别增加至26.1%和26.4%。该结果与先前的研究一致，其结果显示添加SDS 后，超声辅助提取香蕉皮中的果胶显著增加[51]。表面活性剂是具有亲水性头部和疏水性尾部的两亲性分子，当表面活性剂的浓度等于或高于其临界胶束浓度时，将形成胶束[24]。此外，这些胶束可以溶解不同类型的亲水和亲脂化合物，并增强目标物质转移到胶束中，从而提高提取率和回收率[52]。

图2 S-UAE 方法所得果胶提取率Fig.2 Pectin yields by surfactant-mediated ultrasound-assisted extraction （S-UAE）

2.1.5 CE，UAE 和S-UAE 提取果胶的比较 为比较CE，UAE 和S-UAE （SDS，8 g/L）3 种方法所提取果胶的特性，在该工作中测定果胶提取率（PY）、GA 含量、DE 值和平均分子质量（Mw）。如表4所示，使用UAE 法获得的果胶提取率（16.9%）低于CE 提取率（22.5%），表明单独使用UAE 没有显示出比CE 更高的提取效率。然而，S-UAE 的PY 增加至26.4%，比单独使用超声提高55.0%，这意味着S-UAE 显著提高了果胶产量。此外，UAE或S-UAE 的GA 含量远高于CE，表明该果胶具有较高的品质，在食品工业中添加具有优势[19]。

表4 不同方法提取柑橘果胶的品质分析Table 4 The effects of different extraction methods on the qualitative and quantitative characteristics of extracted citrus pectin

在UAE/S-UAE 果胶中检测到DE 值低于传统法中提取的果胶，这意味着使用UAE 法中较低的pH（0.6）有利于果胶的脱酯化。如图3和表4所示，UAE（142.2 ku）获得的果胶的Mw 与CE（137.1 ku）相似。该结果与先前的报道不一致，该研究显示UAE 的果胶Mw （279.47 ku） 低于CE（385.55 ku）[53]。这种不一致性可以解释为该研究中的传统法提取条件（90 ℃，pH 1.0，180 min）与先前研究条件（80 ℃，pH 1.5，90 min）有所不同。表4显示经S-UAE（180.9 ku）制备的果胶Mw 高于单独UAE（142.2 ku）方法，这意味着在S-UAE 过程中更多的生物大分子保持完整。本研究中，所得柑橘果胶的Mw 在8～103ku 范围内，这与之前的研究报道一致[54]。

与CE 法相比，UAE 或S-UAE 法提取的果胶的产量和理化性质发生了很大变化，这些新方法耗时相对较短，提取率较高，节能效果显著。

2.1.6 提取后残留物的SEM 分析 图4为采用不同方法提取后的柑橘皮残余物的SEM 图像。可见，未处理的果皮样品的结构光滑、紧凑（图4a），而经过酸法提胶后，生物质变得松散、分解，且在处理后有更多的纤维暴露（图4b）。图4c和图4d可知，采用UAE 提取后橘皮剥落且多孔，S-UAE提取后皮渣受到更严重的损害。原因在于超声能量渗透到残留物和溶剂中，引起温度和内部压力的快速升高，超声刺激显著破坏了微结构，相关化合物迅速从内部植物材料释放到外部环境，故可显著提高果胶的提取率[10]。

图4 果胶提取前、后柑橘皮粉的扫描电镜图像Fig.4 Scanning electron micrographs of citrus peel powder before and after pectin extraction

2.2 酰胺化改性

酰胺化过程中存在3 种反应，即氨解反应、水解反应和β-消除反应。氨解反应使得-CONH2增加（对应的是目标产物ALMP 增加），水解反应导致-COOH 增加，二者的实质是脱酯过程，使反应物的酯化度下降，故可统称为脱酯反应；β-消除反应是由于产生双键导致果胶链断裂，使得分子质量变小。前期研究表明，同一醇浓度下，氨水浓度增加可降低水解、提高氨解，并且在较高的醇浓度条件下，即便氨水浓度较小，也可最大限度地抑制水解反应，从而保证氨解反应充分进行；醇浓度的增加，可以在一定程度上抑制β-消除反应，保留反应物的分子质量，然而脱酯速率降低，脱酯程度相对较小；一定范围的低温条件下，高浓度氨水可将β-消除反应控制在较小程度，所得产品特性黏度高、DA 值大[28，31，55]。改性过程的一级反应速率方程是K=t-1·ln（C0/C）（C0为初始DE 值，C 为在t 分钟时的DE 值）；NH4OH 在氨醇复合体系液中存在的动态平衡是NH3+H2O⇌NH4++OH-。因此，要获得理想的目标产物ALMP，在综合反应体系里，必须精准调控好氨醇比例及其浓度、反应温度、时间、pH 值和果胶质量浓度等变量。

2.2.1 反应温度的影响 固定果胶质量浓度15 g/L、反应体系pH 11，在不同温度下进行酰胺化反应。由图5可知，随着温度升高，DA 值增大（甲酯基团逐步被胺基取代）；同时随着时间延长，由于存在水解反应和β-消除反应，产品的黏度降低，DE 值下降。本研究选取酰胺化反应温度10℃：1）更低的反应温度，如5 ℃所需能耗大；2）3 h内可将DA 值增加到20%左右，便于连续化生产；3）果胶分子质量的降解程度较小。

2.2.2 pH 值的影响 固定果胶质量浓度15 g/L、反应温度10 ℃，在不同pH 值下进行酰胺化反应。由图6可知，随着pH 值的升高，DA 值增大；在不同pH 值条件下黏度下降比在不同温度条件下的降低趋势平缓，主要原因是低温抑制了β-消除反应。本研究选取pH 11.5 作为酰胺化的反应条件：1）DA 值升高较快，缩短反应时间；2）节约反应原料，降低生产成本；3）减少反应过程对果胶分子质量的破坏。

2.2.3 果胶质量浓度的影响 固定反应温度10℃、反应体系pH 11.5，在不同果胶质量浓度下进行酰胺化反应。由图7可知，随着果胶质量浓度升高，DA 值逐渐下降，体系黏度随之上升导致反应进度下降；同时，随着反应时间的延长，DA 值上升逐渐放缓。本研究选取果胶质量浓度20 g/L 作为酰胺化的反应条件：1）反应比较充分，有利于目标产物生成；2）果胶分子质量破坏程度较小；3）有利于后续的浓缩，节约酒精用量并降低能耗。

2.2.4 产品品质分析 在氨醇复合体系氨水浓度3～4 mol/L，异丙醇体积分数50%～60%，反应温度10 ℃，pH 11.5，果胶质量浓度20 g/L 以及反应时间100～180 min 条件下，可获得不同类型的酰胺化产品，分析得到其相关品质指标如下：酰胺化度（DA）13%～22%、酯化度（DE）29%～39%、半乳糖醛酸（GA）含量69%～84%、黏度136～172 mPa·s、平均分子质量（Mw）148～173 ku。

图5 反应温度对产品质量的影响Fig.5 Reaction temperature effects on the product quality

图6 反应pH 值对产品质量的影响Fig.6 Reaction pH value effects on the product quality

2.3 产业化应用

当前，国内果胶生产企业在提取后液固分离、大批量连续化生产以及酰胺化精准调控等方面存在以下瓶颈：1）高固含、高黏度渣液分离耗时长，果胶损耗高，处理量少；2）高浓度果胶液的浓缩和离析洗涤难以实现大处理量、连续化生产；3）酰胺化精准改性调控及规模化制备几乎被国外垄断。

“十二五”以来，在柑橘果胶加工领域，本课题组与战略合作企业建立了“一级卧螺分离+二级蝶式分离+高浓度浓缩+离析纯化”技术模式，实现高效和连续化生产，综合生产效率提高15%以上。主要取得了以下几个方面的重点突破：1） 实现了高固含、高黏度渣液多级分离产业化（废渣水分含量降至85%，分离处理量提升2 倍至150 m3/h，果胶分离损耗降低1.5 个百分点以上）；2） 通过组合、优化，实现了大流量高浓度果胶液浓缩和离析洗涤产业化的精准控制和大处理量连续化生产，日处理柑橘干皮渣达33 t（可获得柑橘高酯果胶约6 t）；3） 建成达到世界先进水平的酰胺化果胶生产线（年生产能力1 000 t），通过工艺参数改进优化并协同关键装备创新，研发了系列具有不同凝胶、钙敏和流变学特性的酰胺化柑橘果胶产品，达到国外同型号产品质量标准；打破了国外技术封锁和产品市场垄断。

图7 果胶质量浓度对产品质量的影响Fig.7 Pectin mass concentration effects on the product quality

3 结论与讨论

采用Box-Behnken 设计研究超声提取变量（pH 值、时间和LSR）对柑橘果胶提取率（PY）、GA含量和DE 值的影响，结果表明，PY，GA 和DE 分别为12.7%～17.0%，76.6%～87.2%和37.0%～57.9%；果胶提取的最佳条件为超声功率280 W，pH 0.6，时间15 min 和LSR 21.0 mL/g，提取率最大值仅为17.1%。在此基础上，改进添加表面活性剂（SDS，8 g/L）后的超声辅助提取（S-UAE），与传统方法相比，对提取果胶的量和质都有积极作用，具有较高的PY（26.4%）、GA 含量（78.2%）、DE 值（45.5%）和Mw（180.9 ku）。该研究中，S-UAE 表现出传统方法所不具备的一些优势，例如：耗时相对较短，产量更高，质量更好，节能效果显著；因此，S-UAE 是一种高效且具有成本效益的提取方法。下阶段的重点任务是产业化适用的改造与提升。

同时，以获得的柑橘高酯果胶为原料，研究反应温度、pH 值和果胶质量浓度对酰胺化产品质量的影响；结果表明，在温度10 ℃，pH 11.5 和果胶质量浓度20 g/L 的条件下反应100～180 min，获得不同类型的酰胺化产品，其DA 值（13%～22%）、DE 值（29%～39%）、GA 含量（69%～84%）、黏度（136～172 mPa·s）、Mw（148～173 ku），符合相关标准。下一步应聚焦ALMP 的功能性质、个性化产品及其工业化生产的精准控制与大批量连续生产，做更为深入和系统的研究。