结肠腺癌患者预后相关的miRNAs影响因素分析

蒋少杰

在全球癌症相关的死亡数目中，结肠腺癌排在第四位[1]。结肠腺癌的形成是一个复杂而漫长的过程，甚至可以达到20年。在过去的20年中，随着早期诊断技术不断发展，基因检测技术的不断完善，虽然结肠癌症的病死率明显降低，但是发生率依然很高[2]，新的治疗手段也比较缺乏。有些研究[3-4]表明，20%～30%的结肠癌患者具有遗传变异的性质，其中包括基因APC和TP53在癌前病变或腺瘤的形成中起着重要的作用。目前在人类疾病与肿瘤中的非编码基因的作用也受到很大的关注，包括miRNAs或lncRNA，这些非编码RNA可以为结肠癌的诊治和预防提供新的靶点及策略。microRNAs是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，主要通过抑制靶基因的功能来实现的。有些研究结果显示，miRNAs是调控细胞增殖、分化、侵袭和转移的重要调控因子[5]。本研究中使用生物信息学方法来处理miRNA表达谱数据，这些数据都是来自于国际肿瘤数据库(TCGA)中结肠腺癌患者，然后得到差异表达的miRNAs，探讨这些表达差异的miRNAs是否与结肠腺癌患者预后有关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 数据下载 从TCGA网站上下载miRNAs表达谱数据，这些数据包括结肠腺癌患者组织与癌旁组织，还有相对应的临床数据。其中男234例，年龄31～90岁，平均(67±12)岁；女217例，年龄34～90岁，平均(66±14)岁。样本纳入标准：经病理证实为原发性结肠腺癌，术前无任何放化疗经历；完整的临床分期数据和预后的详细信息。经过分析后共计451例结肠腺癌患者纳入临床分析，临床分期：I+II 193例，III+IV 247例，无法确定11例。M分期：M0325例，M165例，肿瘤有无远处转移无法评估(MX)54例，无法确定7例。N分期：N0263 例，N1～N2188 例。T分期：T1+T286例，T3+T4364例，原发肿瘤无法评估 1例。

1.2 数据处理 使用R语言中的limma包对miRNAs表达谱数据进行差异分析，得到差异表达的miRNAs。筛选标准：|log2差异倍数(FoldChange)|>1且P<0.01。

1.3 筛选与结肠腺癌患者预后相关的miRNAs 对结肠腺癌患者癌组织中多个差异表达的miRNAs进行分组，根据每个miRNAs在多个样本中的中值，大于这些中值的样本分为高表达组，低于中值的样本为低表达组。为了筛选出与总体生存期显著差异相关的miRNAs，采用Kaplan-Meier生存曲线分析方法和Log-Rank检验方法分别对高表达与低表达的miRNAs样本与总体生存期(OS)的相关性进行分析。

1.4 Cox回归模型 采用R语言limma包进行统计学分析。应用上述的方法检验各miRNAs高表达和低表达组生存率差异是否具有统计学意义。采用Cox比例风险回归模型来做预后分析方法。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 差异表达miRNAs的筛选 应用R语言limma包筛选出癌组织和癌旁组织差异表达的miRNAs有330个，其中上调的miRNAs有132个，下调的miRNAs有198个。癌组织和癌旁组织中差异表达miRNAs的分布见图1。

图1 癌组织和癌旁组织差异表达的miRNAs分布火山图

2.2 与OS相关的miRNAs筛选 根据所有样本miRNAs的表达中位值，将分成高表达组和低表达组。采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-Rank检验分析330个差异表达的miRNAs与结肠腺癌患者预后的关系。结果显示，hsa-miR-326(P=0.03)、hsa-miR-92a-1(P=0.026)、hsa-miR-92a-2(P=0.012)和hsa-miR-376b(P=0.0099)与结肠腺癌患者的预后呈显著相关。高表达hsa-miR-326与预后差显著相关，而低表达hsa-miR-92a-1、hsa-miR-92a-2和hsa-miR-376b与预后差显著相关,见图2。

采用多因素Cox回归分析结果进一步证实，差异表达的miRNAs与结肠腺癌患者的预后相关,高表达hsa-miR-326(P=0.003)和低表达hsa-miR-92a-1(P=0.002)、hsa-miR-92a-2(P=0.001)和hsa-miR-376b(P=0.002)是结肠腺癌患者预后不良的独立因素,见表1。

图2 与预后显著相关的miRNAs的生存曲线

表1 结肠腺癌患者差异表达miRNAs的多因素Cox回归分析

3 讨 论

miRNAs是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，目前已经证实它们广泛存在于各种真核生物细胞内。miRNA能完全或部分与靶基因mRNA分子的3’端非编码区域发生碱基互补配对，最终抑制靶基因的表达。大量研究结果显示，miRNAs通过染色质重塑，组蛋白修饰和RNA代谢等多种生物学过程在表观遗传、转录和转录后水平调控基因表达。miRNAs与多种癌症相关[6-8]，其异常表达及突变都与肿瘤的发生、发展、凋亡、浸润、迁移以及药物的抗药性密切相关。许多研究表明，在多种癌症患者中，一些miRNAs表达发生改变，可作为某些癌症或疾病诊断及预后的生物标志物[9-11]。TCGA癌症数据库是由美国2005年发起的癌症和肿瘤基因图谱计划，旨在应用基因组分析技术研究癌症中的基因组变化，做大规模的基因组测序，其中包含丰富的样本类型和肿瘤类型。本研究采用生物信息学技术手段，筛选出来自于结肠腺癌患者的差异表达miRNAs 330个进行预后分析、总体生存分析显示，hsa-miR-326、hsa-miR-92a-1、hsa-miR-92a-2和hsa-miR-376b是结肠腺癌患者独立预后的不良因素。Schaefer等[12]报道miR-326通过上调影响小鼠结肠炎症的发生和发展。也有研究证明，miR-326高表达影响结肠癌的转移和预后[13]。Ragusa等[14]证实miR-92a-1参与细胞增殖、迁移、凋亡，并且影响MAPK/ERK等信号通路来导致结肠癌的发生与发展。也有研究发现，miR-92a家族以及它们的靶基因在肿瘤的发生与发展起到了重要作用，包括在结肠癌中[15]。An等[16]报道，miR-376b通过直接靶向Hoxd10基因来促进乳腺癌的转移，因此它将成为乳腺癌的新型治疗靶点和预后生物标志物。综上所述miRNAs可能参与结肠腺癌的发生发展过程，在结肠腺癌恶性进程中发挥重要作用。

4 结 论

本研究对TCGA中结肠腺癌患者大数据进行分析，筛选出与结肠腺癌预后显著相关的hsa-miR-326、hsa-miR-92a-1、hsa-miR-92a-2和hsa-miR-376b。本研究结果提示上述miRNAs分别与各临床参数存在显著相关性，可能为结肠腺癌机制的研究提供理论依据，为寻找结肠腺癌诊断和预后新的分子标志物以及个性化治疗方案提供新的思路。