高黏液型肺炎克雷伯菌耐药性和感染患者临床特征研究

吴 旻，丁洁霞，邹 菁，蒋小仙，金 洁，王淑颖，岑盼盼，陈 琼

(浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院 1.感染科；2.院感科；3.细菌室，浙江 杭州 310006)

高黏液型肺炎克雷伯菌(hypermucoviscousKlebsiellapneumoniae， HMKP)是经典肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiellapneumoniae， cKP)的一个变种，具有较厚的荚膜和脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)，能保护细菌免受血清因子和吞噬作用的影响[1]。HMKP可导致脓毒血症、脓肿、脑膜炎、眼炎和重症肺炎等，致死率高[2-3]。因此，HMKP也被称为高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKP)。2013年，北京佑安医院报道了多重耐药hvKP[4]；2015年，Zhang等[5]首次报道了碳青霉烯类耐药HMKP(carbapenem resistant HMKP，CR-HMKP)菌株；之后浙江[6]、四川[7]、安徽[8]、香港[9]等多地出现了CR-HMKP流行。本研究对HMKP菌株耐药性和感染患者的临床特征进行分析，以期为临床控制HMKP流行提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 菌株来源和鉴定 收集2017年1月—12月于浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院临床分离的65株HMKP菌株，来自41例患者，所有菌株拉丝试验均为阳性[10]。65株HMKP菌株采集自血液18株(27.7%)，胆汁19株(29.2%)，脓液7株(10.8%)，痰液7株(10.8%)，动静脉导管液3株(4.6%)，洁尿3株(4.6%)，关节液、胸水、腹水和脑脊液共8株(12.3%)。13例感染患者在≥2个不同部位培养到HMKP菌株。10例CR-HMKP感染患者中有3例来自消化科，2例来自ICU，2例来自肝胆外科，胃肠外科、脑外科、肾内科各1例。选取来自不重复患者的不重复HMKP菌株41株作为研究菌株，利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)进行菌种鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.2 药物敏感试验和产广谱β内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)表型测定 药物敏感试验和ESBLs表型测定采用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统(Marcy-l Étoile， France)。药敏结果根据2017年美国临床和实验室标准协会(CLSI)标准判定，对亚胺培南或厄他培南耐药的菌株判定为CR-HMKP，对亚胺培南和厄他培南均敏感的菌株判定为碳青霉烯类敏感HMKP(carbapenem susceptible HMKP，CS-HMKP)。

1.3 CR-HMKP菌株多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)和荚膜血清学分型(K分型) 按照巴斯德研究所MLST网站(http://bigsdb.Pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)描述，对7个管家基因进行MLST分析：孵育和收集4 mL CR-HMKP菌液，提取菌株的DNA。以7个管家基因 (gapA、infB、rpoB、phoE、mdh、pgi、tonB) DNA为模板，配制25 μL反应体系，PCR扩增目的基因。PCR反应条件：预变性94 ℃ 2 min，循环94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；最后延伸 72 ℃ 5 min。PCR产物经纯化及双向测序， 将7个管家基因的序列与MLST数据库中已知的等位基因序列比对，获得相应序列号。采用PCR对CR-HMKP菌株进行荚膜血清学分型，包括K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57[4]。

1.4 HMKP菌株毒力因子检测和CR-HMKP菌株碳青霉烯酶基因检测 参考相关文献[11-13]，对41株不重复的HMKP 菌株进行10个毒力因子基因检测，包括荚膜(rmpA，magA)、LPS (uge，wabG)、菌毛(fimH)、含铁细胞(iutA，iroN，entB)和其他毒力基因(allS，kfu)[11-12]。对CR-HMKP菌株的碳青霉烯酶基因(blaKPC-2，blaVIM，blaIMP，blaOXA-48，blaNDM-1)[13]进行检测：孵育和收集4 mL HMKP菌液，提取菌株的DNA；PCR扩增上述目的基因[11-13]。DNA测序，采用Bioedit软件进行序列比对。

1.5 患者临床特征分析 对患者的临床资料进行回顾性分析，包括患者一般资料、感染状况、治疗结局等。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0软件，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株耐药性情况 41株HMKP菌株中有31株CS-HMKP和10株CR-HMKP。3株CS-HMKP菌株检测到ESBLs。CS-HMKP和CR-HMKP菌株抗生素药物敏感性分布见表1。CS-HMKP菌株对除阿莫西林克拉维酸、头孢菌素和氨曲南外的其他测定抗生素敏感，10株CR-HMKP均对替加环素敏感，对其他测定抗生素表现为高度耐药。

表1 HMKP菌株抗生素敏感性分布情况 (mg/L)

2.2 CR-HMKP菌株分子生物学分析结果 10株CR-HMKP均为ST11，荚膜血清型K57型3株，K2型1株，6株未成功分型。40株HMKP分离株中检测到rmpA基因， 39株HMKP中检测到uge基因，34株HMKP中检测到allS基因，36株HMKP中检测到kfu基因。iutA、entB、iroN、fimH和wabG在41株HMKP中均检测到。CS-HMKP菌株与CR-HMKP菌株的毒力基因谱分布相似。10株CR-HMKP菌株均产KPC-2碳青霉烯酶，未检测到其他碳青霉烯酶(VIM， IMP， OXA-48和NDM-1)。

2.3 感染患者临床特征分析 20例(48.8%)感染患者发生迁徙性脓肿，以肝脓肿发生率最高，且主要来自CS-HMKP感染。CR-HMKP感染患者的多部位感染发生率，肺部感染率，尿路感染率及关节液、胸水、腹水和脑脊液的感染率均高于CS-HMKP感染患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。16例(39.0%)HMKP感染患者有合并复数菌感染，主要为肠球菌。CR-HMKP感染患者合并复数菌感染率高于CS-HMKP感染患者，差异有统计学意义(P<0.05)。CR-HMKP感染患者的30天手术外伤史比例、90天内住院史比例、呼吸系统疾病比例均高于CS-HMKP感染患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。留置导管方面，深静脉置管、导尿管留置和胃肠道置管的CR-HMKP感染患者的比例高于CS-HMKP感染患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。CR-HMKP感染患者白细胞计数高于CS-HMKP感染患者，血清白蛋白水平低于CS-HMKP感染患者，凝血酶原时间和住院天数长于CS-HMKP感染患者，SOFA评分、死亡率和医疗费用高于CS-HMKP感染患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 HMKP感染患者临床特征分析

3 讨论

本研究从宿主、病原体和宿主—病原体相互关系对HMKP菌株耐药性、毒力因子分布和感染患者临床特征进行系统研究。本研究分离的CS-HMKP菌株对抗生素保持较高的敏感性，7.3%(3/41)的HMKP菌株产ESBLs，4.9%(2/41)的HMKP菌株表现为多重耐药，低于文献[14]报道的16.3% hvKp产ESBLs和20.0%多重耐药表现。近几年，CR-HMKP频繁地从中国患者中分离[5-9]，且同一株HMKP上常携带多种耐药基因，可能与HMKP对亚裔人种的高感染力和碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem resistantKlebsiellapneumoniae， CRKP)菌株在我国流行传播有一定关系。研究[15]表明，K1和K2荚膜血清型是HMKP主要的荚膜血清型。本研究分离的CR-HMKP菌株荚膜血清型主要以K57型(30%)为主，这是鲜有报道的[16]。质粒介导的碳青霉烯酶是目前造成肺炎克雷伯菌乃至高毒力肺炎克雷伯菌产生碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因[17]。本研究中的CR-HMKP菌株均为含有blaKPC-2基因的ST11型，未检测到其他碳青霉烯酶。研究[18]发现，ST11是产碳青霉烯酶KPC酶的主要克隆型，但在HMKP菌株中很少被报道。自2015年以来，浙江多家医院发生ST11型CR-HMKP菌株的暴发流行[11，19]。有研究[20]发现，CR-hvKP 菌株可同时携带毒力质粒和耐药质粒，甚至耐药基因和毒力基因可通过同一质粒“共传播”。还有研究[21]发现， ST11型肺炎克雷伯菌株存在外膜蛋白OmpK36缺失，这可能是造成菌株高耐药、高毒力和高致病力的原因[22]。CR-HMKP合并ST11在全球范围内的流行应引起关注。

本研究中的10例CR-HMKP感染患者中有8例(80%)发生了多部位侵袭感染，6例(60%)最终死亡，其中1位尿毒症患者和1位脑外伤原发肺部感染患者均在5处不同的标本中培养到CR-HMKP，提示CR-HMKP的传播力和致死率较高。41例HMKP感染的研究病例中，20例(48.8%)出现迁徙性脓肿，其中17例为CS-HMKP感染。12例(29.3%)HMKP感染患者表现为肝脓肿，高于研究[14]报道的hvKP可致10.0%的肝脓肿发生率。本研究还发现3例CS-HMKP感染的社区获得肛周脓肿。

临床特征比较分析表明，有以下情况的患者更易发生CR-HMKP感染： 90天内有住院病史、30天内有手术外伤史、深静脉留置、留置导尿管、胃肠道置管以及低下的营养状态(血清白蛋白水平低下)。CR-HMKP感染也更易出现肺部感染、尿路感染和多部位感染，同时易合并复数菌感染，表现出更明显的白细胞水平上升，SOFA评分提高，凝血酶原时间延长，更高的死亡率和高额医疗费用的支出。这与普遍认同的CRKP感染危险因素一致。