TPM1调节口腔鳞癌的增殖、侵袭迁移及其机制研究

闫大勇 蔡晓清 郭乐乐 钟克涛 张 瑞

口腔鳞癌是世界上最常见的口腔恶性肿瘤，每年有超过27.5万新发病例，将近12.5万患者因此死亡。因其复发率高、转移快、预后差等特点导致口腔鳞癌的5年生存率约为50%[1,2]。因此，研究口腔鳞癌发生、发展的分子机制，为口腔鳞癌诊治提供新的靶点，从而提高治疗效果，具有重要意义。

TPM1(tropomyosin-1)是原肌球蛋白家族成员，在肌肉细胞中通过钙离子调节肌肉收缩，而在非肌肉细胞中具有复杂的功能性[3,4]。有研究表明原肌球蛋白的突变与心脏和骨骼肌疾病直接相关，而原肌球蛋白表达水平的改变与肿瘤的发生、发展密切相关[5,6]。Shin等[7]首先报道了在乳腺癌中TPM1的表达下调并抑制肿瘤的进展，后续研究发现TPM1在肾癌细胞中表达水平上调,并且诱导细胞凋亡和抑制其侵袭[8]。但目前TPM1是否对口腔鳞癌的细胞生物学行为有影响以及影响机制尚不明确。

本研究通过患者的组织样本分析TPM1在口腔鳞癌中的表达水平，通过构建TPM1干扰质粒，检测转染前后细胞增殖、迁移和侵袭功能以及MMPs蛋白表达水平的变化，初步探讨口腔鳞癌发生、发展的可能机制。

资料与方法

1.组织标本采集：收集郑州市中心医院2018年9月～2019年5月口腔鳞癌手术切除的肿瘤组织标本30例及癌旁组织标本7例。选择要求如下：①术前及术后病理证实为口腔鳞癌；②患者术前未行放疗、化疗及其他治疗；③术后病理取材部位包括表面区、中心区、深层浸润区、癌旁组织；④本研究纳入30例研究对象，其中，男性17例，女性13例，患者平均年龄57.3岁(27～71岁)，T1期12例，T2期13例；T3期5例。所有程序经郑州市中心医院医学伦理学委员会审查批准，患者均签署知情同意书。

2.细胞株与主要试剂：人口腔鳞癌细胞株CLA27和HSC3(中国科学院上海细胞库)，RPMI1640培养基(美国Invitrogen公司)，优质小牛血清(美国Invitrogen公司)，GAPDH抗体，MMPs抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。TPM1敲减以及过表达及其空白重组质粒(美国GeneCopoeia公司)，Lipofectamine TM 2000转染试剂(美国Invitrogen公司)。

3.细胞转染：将适量细胞种至6孔板中，至细胞融合达到60%～70%时进行转染。在150μl RPMI1640中分别加入5μl Lipofectamine TM 2000和4μg质粒，室温静置5min，轻轻混匀，孵育20min。弃去原6孔板内的培养基，加入RPMI1640和混合物共1ml，4～6h之后再更换成含有血清的培养基。

4.RT-PCR检测样本中TPM1的表达：Trizol法提取组织/细胞总RNA，使用反转录酶按说明书将其转录为cDNA，再进行PCR反应，扩增条件为 95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环。内参基因为GAPDH，使用2-ΔCt法计算基因相对表达量。

5.细胞增殖：将转染质粒48h后的细胞用胰酶消化并计数，按每孔1500～2000个细胞接种于96孔板内，每组6个复孔。各组细胞在 37℃、5%CO2培养箱中分别培养 0、24、48、72h后使用CCK-8测量。测量时每孔加入10μl CCK-8试剂和100μl培养基混合液，并设立空白对照孔，在培养箱内孵育1h，酶标仪检测 450nm波长处的吸光度值，注意检测时要除去气泡。

6.细胞迁移：在6孔板中加入约106个细胞使过夜后细胞融合率达到 100%。第2天用20μl高压灭菌枪头比着直尺，垂直于标记的横线划痕。PBS洗去除划线时脱落的细胞，加入完全培养基 1毫升/孔。放入37℃、5%CO2培养箱中培养。按 0、6、12、24h取样，在10倍镜头下拍照。使用Image J软件计算面积，通过面积和高度计算平均距离。

7.细胞侵袭：将培养基与Matrigel基质胶以1∶10的比例混合后，在每个小室上室加入90ml，孵育4～6h，待其凝固后，将转染48h的细胞消化并计数，在上室加入200μl细胞悬液(含1×105个细胞)，下室加入800μl培养液，培养48h后取出Transwell小室，将上室中残留细胞擦去，下室采用结晶紫染色20min，PBS 冲洗3～4次后，对膜下方细胞采用观察并计数。每组重复3次。

8.Western blot法检测：细胞转染48h后提取蛋白，检测蛋白浓度。每孔上样20μg，使用10%SDS-PAGE胶电泳分离，之后转移至PVDF膜上。室温下5%脱脂牛奶封闭2～3h，TBST洗3次(每次10min)，随后一抗4℃孵育，摇床过夜，次日TBST洗膜，二抗室温孵育1～2h，洗膜3次之后显影，检测蛋白表达情况。

结 果

1.TPM1的表达水平：RT-PCR检测结果显示，TPM1在人口腔鳞癌组织中相对表达水平显著高于人正常口腔组织中的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 TPM1在口腔鳞癌组织和正常组织中表达水平*P<0.05

2.各组细胞系转染TPM1后相对表达量比较：细胞转染后，与空载组比较，过表达组TPM1表达水平显著升高，且差异有统计学意义(P<0.05)；敲减组TPM1表达水平显著降低，且差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 过表达以及敲减TPM1后TPM1表达水平变化A.CLA27细胞；B.HSC3细胞；与空载组比较，*P<0.05

3.TPM1表达水平对细胞增殖的影响：TPM1过表达后，细胞的增殖速度显著升高；敲减TPM1后，细胞的增殖速度显著降低(P<0.05,图3)。

图3 过表达以及敲减TPM1对口腔鳞癌细胞增殖活性的影响A.过表达TPM1促进细胞增殖；B.敲减TPM1抑制细胞增殖；与空载组比较，*P<0.05

4.TPM1表达水平对细胞迁移的影响：划痕实验显示，过表达TPM1后，细胞的迁移速度显著升高；敲减TPM1后，细胞的迁移速度显著降低(P<0.05,图4)。

图4 过表达以及敲减TPM1对口腔鳞癌细胞迁移活性的影响(×400)A.过表达TPM1促进细胞迁移；B.敲减TPM1抑制细胞迁移;与空载组比较，*P<0.05

5.TPM1表达水平对细胞侵袭的影响：Transwell侵袭实验结果显示，过表达 TPM1后细胞的侵袭能力显著升高；敲减TPM1后细胞的迁侵袭能力显著降低(P<0.05,图5)。

图5 过表达以及敲减TPM1对口腔鳞癌细胞侵袭活性的影响(×400)A.过表达TPM1促进细胞侵袭；B.敲减TPM1抑制细胞侵袭;与空载组比较，*P<0.05

6.干扰TPM1表达对MMPs表达水平的影响：通过前期细胞功能学实验，发现干扰 TPM1的表达会影响细胞侵袭、迁移的能力。进一步通过Western blot法检测MMPs表达水平。结果显示，过表达TPM1后MMP9的表达水平显著上升(P<0.05)，MMP2和MMP7的表达水平不受影响；敲减TPM1后MMP9的表达水平显著下降(P<0.05)，然而MMP2和MMP7的表达水平不受影响(图6)。

图6 过表达以及敲减TPM1对MMPs蛋白表达的影响

讨 论

口腔鳞癌是头颈部鳞癌最常见的类型，大约占口腔恶性肿瘤的90%。尽管口腔鳞癌的发生率和病死率最近逐渐降低，但是其5年生存率仍然低于50%[9～11]。普遍认为，淋巴结转移和远处转移是导致口腔鳞癌患者死亡的主要原因[12]。因此，阐明调节口腔鳞癌转移的潜在机制对于口腔鳞癌的治疗至关重要。但是，口腔鳞癌转移的潜在分子机制至今尚不清楚。本研究通过RT-PCR检测口腔鳞癌组织和癌旁组织标本TPM1的表达情况，选取CLA27和HSC3细胞作为后续实验对象，构建TPM1干扰质粒。采用RT-PCR检测TPM1转染后表达效果，采用CCK-8检测细胞0、24、48和72h增殖情况，划痕实验检测细胞迁移，Transwell检测细胞侵袭能力，Western blot法检测MMP家族蛋白表达情况，探究了TPM1在口腔鳞癌组织中的表达情况及对人口腔鳞癌细胞恶性表型的影响，这将有助于理解口腔鳞癌发生、发展的分子机制，为口腔鳞癌的诊断治疗提供新的靶点。

TPMs是一类原肌球蛋白，有大约40种亚型，它们在应激纤维调节和肌动蛋白细胞骨架修饰中起关键作用[13]。近年来，大量研究表明TPMs与肿瘤细胞的迁移、侵袭密切相关[14, 15]。在所有原肌球蛋白家族成员中，TPM1最常参与癌症的发展[16]。研究表明，TPM1作为重要的抗肿瘤基因在乳腺癌，结肠癌和膀胱癌在内的各种实体瘤中的表达均被下调[17]。

最近的研究证实了TPM1在乳腺癌细胞中的抗肿瘤作用。Ras-ERK信号通路通过抑制TPM的表达来抑制TGF-β诱导的应激纤维变化，从而导致肿瘤细胞更具侵袭性。此外，TPM1过表达可诱导细胞凋亡并抑制肾癌细胞的侵袭[8]。尽管许多研究表明TPM1在多种肿瘤类型中均具有抑癌作用，但其在口腔鳞癌中的作用及其潜在机制仍然未知。

本研究探索了TPM1对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。研究发现TPM1在口腔鳞癌组织中高表达，提示TPM1可能是口腔鳞癌的不良预后指标。笔者分别在CLA27和HSC3细胞系过表达和敲低TPM1，结果表明，TPM1的过表达促进口腔鳞癌中的细胞增殖，敲减抑制了口腔鳞癌细胞增殖能力，说明干扰质粒成功转染了CLA27和HSC3细胞，并且调节了细胞中TPM1的表达。划痕实验显示过表达TPM1之后细胞的迁移能力显著增强，敲减之后迁移能力显著降低，说明TPM1表达对维持口腔鳞癌细胞的生长有重要作用。Transwell实验发现过表达 TPM1显著增强了细胞的侵袭能力，说明TPM1表达对维持口腔鳞癌细胞的迁移有重要作用。研究表明MMPs在调节肿瘤的侵袭、迁移和血管生成中发挥重要作用[18]。本研究通过Western blot法检测表明TPM1的过表达显著上调MMP9，而对MMP2、MMP7的表达没有影响，说明TPM1可能通过MMP9调节口腔鳞癌细胞的恶性表型。MMP9主要来源于肿瘤细胞的分泌，其在肿瘤组织内的高表达可能在口腔鳞癌的侵袭和转移过程中起重要作用。该机制的发现有助于对口腔鳞癌侵袭和迁移的评价提供有意义的参数。但本研究仍然存在一些不足之处，TPM1调节肿瘤发生、发展的机制有待于进一步探索，后续可通过动物实验进一步验证。

综上所述，TPM1可能通过MMP9调节口腔鳞状癌细胞增殖、迁移和侵袭。TPM1可能作为新型肿瘤标志物为口腔鳞状细胞癌的诊断治疗提供新的靶点。