昆虫病原线虫对草原毛虫幼虫的致病力

白海涛，王 伟，2，3，魏希杰，2，3，韩日畴，徐成体，2，3*

(1. 青海大学农牧学院，西宁 810016；2. 青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室，西宁 810016； 3. 青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016；4. 广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室， 广东省科学院动物研究所，广州 510260)

青海省地处青藏高原腹地，是我国五大牧区之一。青海省有可利用草地面积3 161.03万hm2，其中可利用高寒草甸草地面积2 141.25万hm2，占全省可利用草地面积的68%。全省草原毛虫分布面积106.19万hm2，虫口密度≥30头/m2，为害面积70.17万hm2，是青海省草地的重要害虫(何德孝，2003)。

草原毛虫中文学名为黄斑草毒蛾Gynaephoraalpherakii，属鳞翅目Lepidoptera毒蛾科Lymantriidae草原毛虫属Gynaephora，属青海省特有草原害虫，我国草原毛虫属的8个种均分布于青藏高原(张棋麟，2013)，为害青海省高寒草甸类草地的主要种是青海草原毛虫Gynaephoraqinghaiensis(青海草原毛虫幼虫的足、前胸和肛上板均为黄色)。高寒草甸类草地中丰富的莎草科、嵩草科及禾本科植物(张卫国，2005)为草原毛虫提供了凉爽、湿润的生长及繁衍环境。

草原毛虫一年发生一代，各龄期生长发育时间随环境气候的变化而变化。通常情况下，草原毛虫1～3龄幼虫生长发育期处于5月中旬至6月中旬，1龄幼虫发育周期平均14 d，2龄幼虫发育周期12 d，3龄幼虫发育周期13 d；草原毛虫4～5龄幼虫生长发育期处于6月下旬至7月中旬，该期间气温偏低、雨水较大，毛虫幼虫的活动受到一定制约，幼虫生长缓慢，龄期较长，4龄幼虫发育周期平均17 d，5龄幼虫发育周期18 d；草原毛虫6龄幼虫生长发育期处于7月下旬至8月上旬，该期间气候凉爽，牧草营养丰富，完成一个龄期仅需12 d(马玉海，1994；张棋麟，2013)。

针对草原毛虫的防治，现阶段的防治方法主要是通过2%苦参碱水剂(余慧芩，2016)和0.5%蛇床子素水乳剂对草原毛虫进行防治，而生物防治草原毛虫的研究未见报道。

昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematodes，EPN)是近年来新型的生物防治手段，是一种安全有效的生物制剂。线虫侵染期幼虫可以通过口器、肛门、气孔或直接刺破寄主壁进入寄生昆虫体内，释放共生菌，共生菌在血淋巴中迅速繁殖，使被寄生昆虫患败血病死亡(韩日畴，2007；范芳芳，2015)。这类线虫具有能够自主搜寻寄生并杀死害虫，对人畜、环境安全，能够以人工培养基低成本大量培养等优点，是国际上新型的高效生物杀虫剂(Georgis，2006)。目前我国各地区应用昆虫病原线虫防治鳞翅目害虫的报道有很多，如桃透翅蛾Synanthedonexitiosa、葡萄根透翅蛾ParanthreneregalisButler、黄地老虎Agrotissegetum、斜纹夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)、腰果云翅斑螟等(Shapiro-Ilanetal.，2010；Williamsetal.，2011；张安邦，2015；王丽丽，2015；张中润，2017)，但尚未见过在高寒草甸类草地利用昆虫病原线虫防治草原毛虫的研究。为探究昆虫病原线虫对草原毛虫的侵染效果，本研究通过筛选昆虫病原线虫品系，探究不同环境温度下、不同剂量的昆虫病原线虫对草原毛虫幼虫的室内致病力，以期为草原害虫生物防治工作提供基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1昆虫病原线虫

SteinernemalongicaudumX-7，S.carpocapsaeAll，S.feltiaeSN，HeterorhabditisindicaLN2和H.bacteriophoraH06的感染幼虫(Infective juveniles，IJs)由广东省科学院动物研究所昆虫病原线虫潍坊生产基地提供。

1.1.2草原毛虫5龄幼虫

采自青海省玉树州称多县珍秦乡(北纬33°24′38″，东经97°18′17″，海拔4 261 m)。

1.1.3供试线虫的制备

取两药匙昆虫病原线虫粉剂分别溶解至装有400 mL无菌水的三角瓶中，摇匀，得到线虫稀释液。用微量取样器汲取25 μL线虫稀释液滴至培养皿上，解剖镜下计算存活线虫浓度。

1.2 方法

1.2.1昆虫病原线虫的筛选

制备5种供试线虫制剂，浓度设置为2 500 IJs/mL。

在培养皿(9 cm)中垫两层中速滤纸，并放入10片7 cm牧草嫩叶，每皿放入5头草原毛虫幼虫，分别向各培养皿中滴加1 mL 2 500 IJs/mL的各供试线虫。每种线虫侵染处理重复3次，设置无菌水对照。将培养皿置于20±2℃、RH 80%～85%，无光照培养箱中，每24 h补充更换饲料。处理24 h、48 h和72 h后观察毛虫幼虫的死亡情况，记录总虫数及死虫数。

1.2.2不同温度下昆虫病原线虫对草原毛虫幼虫的致病力

制备供试线虫制剂，线虫浓度设置为2 500 IJs/mL，温度梯度设为11℃，18℃，25℃、32℃。

每个培养皿(9 cm)底垫两层中速滤纸，放入5头5龄幼虫和10片7 cm牧草嫩叶，滴加1 mL 2 500 IJs/mL供试线虫。每种线虫侵染处理重复3次，设置无菌水对照。将每个处理分别放置到不同温度的人工气候培养箱中(相对湿度为80%～85%、无光照)，每24 h补充更换饲料；每24 h观察一次，连续观察144 h，统计死虫数目。

1.2.3不同剂量的昆虫病原线虫对草原毛虫幼虫的致病力

针对夏季高寒草甸草地气候条件，测定低温环境下(11℃)不同剂量线虫对草原毛虫的致病力的影响。供试线虫4个梯度浓度液分别为2 000 IJs/mL、2 500 IJs/mL、3 000 IJs/mL、3 500 IJs/mL。

每个培养皿(9 cm)底垫两层中速滤纸，每个培养皿中放入5头5龄幼虫并放入10片7 cm牧草嫩叶，滴加1 mL相应浓度的供试线虫至培养皿中。每种线虫侵染处理重复3次，设置无菌水对照。置于温度11±2℃、RH 80%～85%、无光照的人工气候培养箱中；每24 h观察1次，连续观察144 h，统计死虫数目并按时补充更换饲料。

1.3 数据统计

所有数据均在Excel 2003与SPSS 19 for Windows(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)统计分析软件上完成，处理间经反正弦转换及方差分析统计差异显著后，用Duncan氏多重比较方法进行显著性测定。

死亡率(%)=线虫寄生致死虫数÷处理总虫数×100

校正死亡率(%)=(处理死亡率-对照死亡率)÷(1-对照死亡率)×100

2 结果与分析

2.1 昆虫病原线虫的筛选

5种昆虫病原线虫处理草原毛虫72 h后，SteinernemacarpocapsaeAll和SteinernemafeltiaeSN线虫对草原毛虫的致死率(幼虫死亡率分别为83.75%、100%)显著高于S.longicaudumX-7、H.indicaLN2和H.bacteriophoraH06(F=23.300，df=5，12，P<0.05)(表1)。随着处理时间的延长，H.indicaLN2和H.bacteriophoraH06线虫对草原毛虫的致死力没有显著地增长，72 h内草原毛虫死亡率均低于20%，而S.carpocapsaeAll、S.feltiaeSN线虫对草原毛虫的致死率则高达80%以上。

表1 5种昆虫病原线虫对草原毛虫幼虫的致死率Table 1 Mortality of Gynaephora alpherakii 5th instar larvae treated by 5 entomopathogenic nematode species

2.2 不同温度下S. carpocapsae All，S. feltiae SN线虫对草原毛虫幼虫的致病力

2.2.1不同温度下S.carpocapsaeAll线虫对草原毛虫幼虫的致病力

不同温度下S.carpocapsaeAll线虫对草原毛虫的致死率见表2。当温度为11℃，处理48～72 h草原毛虫死亡率为0%；当温度为18℃、25℃和32℃，处理48 h毛虫幼虫死亡率分别为13.33%、86.67%、13.33%；处理后72 h草原毛虫死亡率分别为86.67%、100%、66.67%。处理后72 h，25℃毛虫死亡率显著高于其他3个温度下毛虫的死亡率(F=32.486，df=3，8，P<0.05)，过高和过低的温度均对S.carpocapsaeAll线虫的侵染力有一定的影响，且随着侵染时间的延长，毛虫死亡率提高。

表2 在不同温度下Steinernem carpocapsae All线虫(2 500 IJS/mL)对草原毛虫幼虫的致死率Table 2 Corrected mortality of Gynaephora alpherakii 5th instar larvae treated by Steinernema carpocapsae All at 2 500 IJS/mL at different temperatures

2.2.2不同温度下S.feltiaeSN线虫对草原毛虫幼虫的致病力

不同温度下S.feltiaeSN线虫对草原毛虫的致死率见表3。随着侵染时间的增长，毛虫幼虫的致死率逐渐增长。处理48 h后，11℃、18℃、25和32℃温度下草原毛虫死亡率分别为13.33%、20%、66.67%、13.33%；处理72 h后，11℃、18℃、25℃和32℃温度下草原毛虫死亡率分别为40%、60%、93.33%、46.67%。25℃时，S.feltiaeSN线虫对草原毛虫的致死率显著高于其他3个温度下的致死率(F=8.130，df=3，8，P<0.05)，且随着侵染时间的延长，幼虫死亡率提高。25℃相对于其他3个温度更适宜S.feltiaeSN线虫的侵染活动。

表3 在不同温度下Steinernema feltiae SN线虫(2500IJS/mL浓度)对草原毛虫幼虫的致死力Table 3 Corrected mortality of Gynaephora alpherakii 5th instar larvae treated by Steinernema feltiae SN at 2 500 IJS/mL at different temperatures

2.3 不同剂量S. carpocapsae All和S. feltiae SN对草原毛虫幼虫的致死力

2.3.1不同剂量S.carpocapsaeAll线虫对草原毛虫幼虫的致死力

在11℃下处理后120 h，2 500 IJs/mL、3 000 IJs/mL和3 500 IJs/mL剂量下S.carpocapsaeAll线虫对草原毛虫的致死率无显著性差异，草原毛虫死亡率分别为40%、60%、66.67%，显著高于2 000 IJs/mL剂量下草原毛虫的死亡率(F=8.333，df=3，8，P<0.05)(图1)。高于2 500 IJs/mL的线虫剂量对草原毛虫的致死率差异不显著。

图1 11℃时不同浓度Steinernema carpocapsae All线虫对草原毛虫幼虫的致死率Fig.1 Corrected mortality of Gynaephora alpherakii 5th instar larvae treated by Steinernema carpocapsae All at different concentrations at 11℃ 注：不同小写字母表示在0.05水平差异显著。下图同。Note：The same lines with different letters indicate significant differences between different treatments(P<0.05).Same below.

2.3.2不同剂量S.feltiaeSN线虫对草原毛虫幼虫的致死率

在11℃下处理后120 h，3 500 IJs/mL剂量下S.feltiaeSN线虫对草原毛虫的致死率为93.33%，显著高于2 000 IJs/mL、2 500 IJs/mL剂量下毛虫的死亡率(F=8.333，df=3，8，P<0.05)，与3 000 IJs/mL剂量下S.feltiaeSN线虫的致病力无明显差异。随着线虫剂量的增加，S.feltiaeSN线虫对草原毛虫的致死率显著提高。

图2 11℃时不同浓度Steinernema feltiae SN线虫对草原毛虫幼虫的致死率Fig.2 Corrected mortality of Gynaephora alpherakii 5th instar larvae treated by Steinernema feltiae SN at different concentrations at 11℃

3 讨论与结论

我国成功应用斯氏线虫防治鳞翅目害虫的例子有很多，如赵奎军(1996)应用斯氏线虫防治8种鳞翅目、鞘翅目害虫的研究中，S.feltiaeBeijing品系线虫对鳞翅目害虫的侵染效果均在70%以上，其中对向日葵螟Homoeosomanebulellum和小菜蛾Plutellaxylostell的侵染效果均达到94.7%～100%。张安邦(2015)等利用昆虫病原线虫对黄地老虎Agrotissegetum致病力的研究中，表明其对黄地老虎有着较高的致病力，防治效果高达96.67%。姚红燕(2015)等在防治斜纹夜蛾幼虫的研究中，利用斯氏线虫对其进行侵染测定，在一定条件下，48 h和72 h线虫对斜纹夜蛾幼虫的致病力分别达到了86.67%和93.33%。2018年报道过S.carpocapsaeAll线虫对6龄舞毒蛾Lymantriddispar幼虫侵染效果的研究(滑莎，2018)，室内侵染效果达到100%。

本研究结果表明，温度在25℃时S.carpocapsaeAll、S.feltiaeSN线虫对草原毛虫幼虫均有较高的致死率，且随着线虫剂量的增加，线虫对草原毛虫幼虫的致死率也随之提高，处理72 h草原毛虫死亡率均达90%以上；温度在11℃时S.feltiaeSN线虫对草原毛虫的致病力强于S.carpocapsaeAll线虫，处理144 h后草原毛虫的死亡率高达100%，而S.carpocapsaeAll线虫处理的草原毛虫死亡率仅为60%，且随着线虫浓度的增加，草原毛虫死亡率无显著提升。本论文结果可为利用S.feltiaeSN线虫于低温的草原环境下防控草原毛虫幼虫提供参考和依据。