欧洲黑蜂和新疆黑蜂越冬期抗氧化酶活性及相关基因表达分析

刘楠楠，张 发，徐 凯，王永胜，牛庆生

(吉林省养蜂科学研究所，吉林132108)

欧洲黑蜂Apismelliferamellifera(European Dark Bee)是西方蜜蜂ApismelliferaLinnaeus的一个亚种，原产于阿尔卑斯山以西和以北的欧洲地区，早期随着欧洲移民和商业往来分布至全世界，现有的英国蜂、德国蜂、法国棕蜂、俄罗斯中蜂等都属于欧洲黑蜂的地方品种(席芳贵，1995)。2007年，我国第一次通过官方渠道正式引进欧洲黑蜂，批准吉林省养蜂科学研究所从俄罗斯基洛夫市引进种蜂王，现已利用基因库活体保存纯种欧洲黑蜂70群(刘玉玲等，2018)。

新疆黑蜂(Xinjiang Black Bee)是我国境内西方蜜蜂的一个地方品种，在20世纪初由俄国传入中国新疆伊犁和阿勒泰地区，经过长期混养、自然杂交和人工选育后，逐渐形成的一个适应新疆当地蜜源和气候条件的蜂蜜高产型蜂种(薛运波，2017)，2006年被农业部列入《国家级畜禽遗传资源保护名录》。目前新疆黑蜂饲养数量急剧减少，种性退化严重，物种处于濒危状态(张海峰，2018)。

欧洲黑蜂和新疆黑蜂均属于西方蜜蜂的黑色蜂种，虽然性情凶暴，极易蜇人，不易驯养(葛凤晨，2017；刘玉玲等，2018)，但它们同样拥有优于其他西方蜜蜂品种的优良性状，具有抗逆性和抗病力强、耐寒性好、生产性能和越冬性能优异、善于利用零星蜜源和大宗蜜源等生物学特性，尤其是在恶劣的气候和蜜源条件下展现出的强韧生命力。例如，欧洲黑蜂与其它品种杂交，其子代常表现出不寻常的生活力和产蜜能力，在蜜源较贫乏地区，其他蜂种常耗尽所有贮蜜，唯有勤俭的黑蜂，尚余些存蜜(席芳贵，1995)；新疆黑蜂在越冬期漫长，冬季极端温度达-40℃的自然条件下，仍可在室外安全越冬；在室内越冬同其他蜂种相比更耐寒和省饲料，在早春室外气温8℃左右，即可出巢采集(哈力木拜克，2009)。因此，它们是蜜蜂品种家族中重要的种质遗传资源，极有生产利用价值和育种开发应用潜力。

蜜蜂个体的抗氧化能力与蜂群的寿命、抗病力和抗逆性有着直接联系(肖培新，2010)，抗氧化酶的功能是清除机体内过剩的活性氧，保护机体免受环境胁迫的危害(Bolter and Chefurka，1990)，抗氧化酶基因的表达可在一定程度上体现蜜蜂的生存状况、健康程度和寿命(刘春蕾等，2017)。昆虫在低温不良环境下，体内抗氧化酶活力明显升高，多种酶协同作用调节活性氧变化(唐维媛等，2016)，对耐寒的金针瘿蚊越冬幼虫的冷激处理研究表明，体内的氧化酶活性上升，对昆虫并未造成氧化损伤(Marcelo and Tania，2002)；对越冬期意大利蜜蜂的研究表明，不同越冬饲料有助于提高越冬蜜蜂中肠的抗氧化能力，利于蜂群经受冬季低温的制约(刘春蕾等，2017)。谷氧还蛋白(Grx)、甲硫氨酸亚砜还原酶A(MsrA)和卵黄原蛋白(Vg)是昆虫体内抗氧化酶家族的重要成员，在蜂群抵抗不良环境因素过程中发挥维持氧化还原平衡、参与受损蛋白修复和保护机体免受氧化损伤的作用(赵红霞等，2010；巩志宏，2011；姚朋波，2014)。蜜蜂中含有已确定的Grx1和Grx2两个基因，预测分析它们分别定位在细胞质和线粒体中(巩志宏，2011)，参与维持细胞内氧化还原稳态、生长抑制和细胞凋亡等过程(Damdimopoulosetal.，2002；黄金昌和郭荣富，2010)。MsrA基因是生物体内的抗氧化及蛋白修复因子(Levineetal.，1999)，具有间接的抗氧化作用，在对中华蜜蜂MsrA基因的克隆及其表达分析的研究中推测，它在抵抗高温和紫外线的外界胁迫过程中发挥了重要作用(巩志宏，2011)。Vg基因在蜜蜂的胚胎营养(Rutz and Lüscher，1974)、行为调控(Engels and Fahrenhorst，1974)、延长寿命(Amdametal.，2005；Seehuusetal.，2006)和气候适应(Flurietal.，1977)等方面发挥重要作用，现有研究已明确Vg基因可帮助欧洲蜜蜂适应低温环境(Amdametal.，2005)，从而提高蜂群的抗寒能力。越冬期是养蜂生产管理的重要阶段，当年的蜂群越冬效果直接决定了翌年的基础蜂群数量，而蜂群的耐寒性则是安全越冬的关键因素之一。目前，关于欧洲黑蜂和新疆黑蜂在冬季自然寒冷环境下体内抗氧化酶活性及相关基因表达分析的研究还未见报道。

本试验选取越冬时期的欧洲黑蜂和新疆黑蜂进行越冬性能指标的测定和抗氧化酶活性变化及相关功能基因表达的分析，以评价两个蜂种的越冬性能，明确二者在越冬期的抗氧化酶变化规律和相关功能基因的表达情况，探讨蜜蜂机体在受低温环境胁迫时体内存在的抗氧化防御作用机制和变化规律，更好地了解它们对越冬的适应能力，进而为抗寒蜂种的选育研究奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 试验蜂群

试验所用蜜蜂为纯种欧洲黑蜂和新疆黑蜂，由吉林省养蜂科学研究所蜜蜂遗传资源基因保护中心提供。

1.2 试验时间和地点

2017年10月至2018年3月，吉林省养蜂科学研究所蜜蜂遗传资源基因保护中心南山蜂场。

1.3 主要试剂和仪器

总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒、总超氧化物气化酶(T-SOD)试剂盒和过氧化氢酶(CAT)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；PrimeScriptTMRT Master Mix反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ荧光定量试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；总RNA提取试剂Trizol，购自美国Invitrogen公司。

Ultrospec 7000紫外可见分光光度计，英国柏楉有限公司；Thermo Scientific Sorvall Stratos低温高速离心机；7500 FAST型实时荧光定量仪(ABI)；9902型触摸式PCR仪(ABI)；Invitrogen Qubit 3.0 Fluorometer荧光定量仪(美国Life公司)。

1.4 试验方法

1.4.1样品采集

在蜂群越冬前标记2个品种新出房的工蜂，整个越冬期内每月相同日期(当月的21日)进行一次样品采集，置于-80℃超低温冰箱内保存，备用。

1.4.2越冬蜂群管理

选取欧洲黑蜂(群号分别为E5-1、E5-37、E5-54和E5-147)和新疆黑蜂(群号分别为X5-12、X5-107、X5-116和X5-143)试验蜂群各4群，在越冬前补喂越冬饲料，各品种蜂群以每群5框蜂为标准进行平衡，蜂数多的调出，蜂数少的从本品种内的蜂群中补充，保持群势相当。入室越冬时将两个品种蜂群同时称量蜂群重量，摆放在同一越冬室内越冬。试验蜂群于2018年11月21日入室越冬，次年3月21日出越冬窖。

1.4.3越冬性能指标测定

1.4.3.1 蜂群损失率

记录越冬开始蜂数(框)、越冬结束蜂数(框)，计算越冬期蜂群损失率。

1.4.3.2 饲料消耗率

记录越冬入室蜂群重量(kg)、越冬出室蜂群重量(kg)，计算越冬期蜂群饲料消耗率。

1.4.4抗氧化酶活性测定

以当年的10月和11月为蜜蜂越冬前期，12月和次年1月为蜜蜂越冬中期，次年2月和3月为蜜蜂越冬后期，测定蜜蜂样本的抗氧化酶活力值。严格按照试剂盒说明操作，制备组织匀浆液，计算得出越冬时期每月样品的T-AOC(总抗氧化能力)、T-SOD酶(总超氧化物歧化酶)和CAT酶(过氧化氢酶)酶活力值。测定时每组样品做3个平行处理，所有待测样本为同一批次。

1.4.5抗氧化能力相关基因表达量测定

1.4.5.1 总RNA提取和cDNA第一链的合成

将蜜蜂样品经液氮研磨后，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，在荧光定量仪上测定OD260/OD280，检测提取的RNA样品浓度和纯度，再根据PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒说明书反转录合成cDNA模板，4℃保存备用。

1.4.5.2 引物设计

以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因,目的基因引物设计参考序列来自于NCBI数据库，委托上海生工生物科技有限公司完成，基因引物序列如表1所示。

表1 试验所使用的引物

1.4.5.3 实时荧光定量PCR检测

根据TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR，测定蜜蜂越冬期工蜂抗氧化功能相关基因SOD、CAT、Grx1、MsrA和Vg基因的mRNA相对表达量。反应体系总体积为20 μL，包含cDNA模板2 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL。反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火及延伸34 s，45个循环。每组样本重复测定3次。

1.5 数据处理与分析

将获得的实验数据应用SPSS 19.0软件统计处理，采用数据分析中的one-way ANOVA进行单因素方差分析(P< 0.05表示差异显著)，随后采用Tukey’s HSD进行多重检验；荧光定量PCR中，根据标准曲线以及荧光曲线的Ct值，采用2-ΔΔCt法进行数据分析；应用GraphPad Prism 8.0软件进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 越冬蜂群势测试

在欧洲黑蜂和新疆黑蜂的越冬期间，欧洲黑蜂和新疆黑蜂的蜂群损失率分别为32.86%和32.91%，饲料消耗率分别为23.41%和23.91%(表2)。由此可见，两个蜂种在越冬性能表现方面大体相当。

2.2 越冬期体内抗氧化酶活性变化

2.2.1总抗氧化酶(T-AOC)活性

欧洲黑蜂和新疆黑蜂越冬各阶段T-AOC酶活力进入越冬期后呈逐步升高趋势，仅在越冬中期(1月份)有所下降，之后逐步升高，在越冬后期达到最高值，且差异显著(P<0.05)(图1)。

表2 欧洲黑蜂和新疆黑蜂越冬蜂群势测试统计表

图1 越冬期欧洲黑蜂和新疆黑蜂的T-AOC酶活性变化Fig.1 Changes of T-AOC activity of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.2.2总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性

欧洲黑蜂和新疆黑蜂进入越冬期后，两者的T-SOD酶活性均呈下降趋势，在越冬中期(1月份)达最低值，在越冬后期有所升高，且差异显著(P<0.05)(图2)。

图2 越冬期欧洲黑蜂和新疆黑蜂的T-SOD酶活性变化Fig.2 Changes of T-SOD activity of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.2.3CAT酶活性

欧洲黑蜂和新疆黑蜂越冬各阶段的CAT酶活力呈现先升高再降低又再升高的趋势，在越冬中期(1月份)达最低值，且差异显著(P<0.05)(图3)。

图3 越冬期欧洲黑蜂和新疆黑蜂的CAT酶活性变化Fig.3 Changes of CAT activity of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.3 越冬期体内抗氧化能力相关基因的表达量变化分析

2.3.1SOD基因mRNA表达量

欧洲黑蜂和新疆黑蜂在越冬各阶段的SOD基因mRNA相对表达量均在越冬中期(12月和1月)达到最低值，与SOD酶活性的变化规律大致相同(图4)。

图4 越冬期欧洲黑蜂和新疆黑蜂SOD基因的表达变化Fig.4 Changes of gene SOD expression of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period注：图中不同字母表示在该基因在不同越冬时期的表达量存在显著差异(P<0.05)。下图同。Note: Data with different letters indicated significant difference between different overwintering period at 0.05 level.The same below.

2.3.2CAT基因mRNA表达量

欧洲黑蜂的CAT基因mRNA相对表达量呈先降低再升高的趋势，新疆黑蜂的CAT基因表达量亦呈先降低再升高的趋势(越冬前期基因表达量差异不显著)，且二者均在越冬中期(12月和1月)达到最低值，与CAT酶活性的变化规律一致(图5)。

图5 越冬期欧洲黑蜂和新疆黑蜂CAT基因的表达变化Fig.5 Changes of gene CAT expression of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.3.3Grx1基因mRNA表达量

欧洲黑蜂和新疆黑蜂在越冬各阶段的Grx1基因mRNA相对表达量均在越冬后期(2月和3月)急剧升高，达到峰值，且差异显著(P<0.05)(图6)。

图6 越冬期欧洲黑蜂和新疆黑蜂Grx1基因的表达变化Fig.6 Changes of gene Grx1 expression of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.3.4MsrA基因mRNA表达量

欧洲黑蜂的MsrA基因mRNA相对表达量呈现先降低再升高的趋势，在越冬中期(12月)达最低值；新疆黑蜂的MsrA基因表达量呈现相同的表达规律，也在越冬中期(1月)达到最低值(图7)。

图7 越冬期欧洲黑蜂和新疆黑蜂MsrA基因的表达变化Fig.7 Changes of gene MsrA expression of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.3.5Vg基因mRNA表达量

欧洲黑蜂和新疆黑蜂在越冬各阶段的Vg基因mRNA相对表达量在越冬中前期(10月、11月和12月)均呈逐渐升高趋势；在越冬的中后期(1月、2月和3月)，欧洲黑蜂的Vg基因表达量呈递增趋势，新疆黑蜂则呈递减趋势，表明较越冬前期和后期，越冬中期可能是Vg基因表达的一个时间节点(图8)。

图8 越冬期欧洲黑蜂和新疆黑蜂Vg基因的表达变化Fig.8 Changes of gene Vg expression of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

3 结论与讨论

蜜蜂是农业作物中普遍存在的传粉媒介，养蜂业亦是农业增产的重要途径(刘朋飞等，2011)。蜂群的安全越冬对翌年的养蜂生产至关重要，在冬季，蜂群以众多工蜂和蜂王的组合通过聚集成团的方式来抵御严寒，低温冷害是蜜蜂生存所面临的重要非生物逆境胁迫，欧洲蜜蜂和新疆黑蜂不仅具有较强耐寒性，还具有优异的生产性能，了解它们的越冬期生理及生存策略对于保护和保存这种宝贵的种质资源至关重要。

昆虫体内的抗氧化防御系统作为机体抵御外界逆境条件胁迫的一道防线，在生物体中占有举足轻重的地位，一旦其抗氧化防御机制被打破，自由基的产生就会增多，从而引起氧化应激损伤(吴启仙和夏嬙，2014)。总抗氧化能力(T-AOC)是反映生物体内抗氧化能力的重要指标，超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)则属于昆虫体内存在的保护酶系统(Fridovich，1977)，相互协作调控增强机体的抗逆性(刘楠楠等，2018)。Grx基因、MsrA基因和Vg基因亦是昆虫在不利条件下发挥重要调控作用的抗氧化功能基因(Ruanetal.，2002；Anetal.，2013；张卫星和胥保华，2014)。

本研究结果表明，欧洲黑蜂和新疆黑蜂在蜂群损失率和饲料消耗率的越冬性能表现方面无明显差异，分别为32.86%、23.41%和32.91%、23.91%；薛运波等(2003)等连续两年对喀尔巴阡蜂、卡尼鄂拉蜂、高加索蜂、美意蜂、澳意蜂和原意蜂的越冬蜂群进行越冬测试，结果显示黑色蜂种对比黄色蜂种的越冬群势削弱率和越冬饲料消耗相对较少，认为黑色蜂种的耐寒性能较强，也进一步验证了本研究的结论，即黑色蜂种更具有越冬优势。

在抗氧化酶活性表现方面，T-AOC酶活力总体呈逐步升高趋势，仅在越冬中期(1月份)有所下降，越冬后期达峰值；T-SOD酶活性在越冬中期(1月份)达最低值，后期又呈升高趋势；CAT酶活力呈现先升高再降低再升高的趋势，在越冬中期(1月份)达最低值。在抗氧化酶基因表达方面，两个蜂种的SOD基因和CAT基因的表达模式与酶活性的变化基本一致，均在越冬中期(12月和1月)达到最低值；Grx1基因的表达量在越冬后期急剧升高，达到峰值；欧洲黑蜂和新疆黑蜂的MsrA基因的表达量分别在越冬中期(12月和1月)达最低值；越冬中期可能是两个蜂种Vg基因的表达的时间节点，在越冬中前期均呈逐渐升高趋势，到了越冬中后期，欧洲黑蜂的Vg基因表达量呈递增趋势，新疆黑蜂则呈递减趋势。综合以上实验结果可知，一方面，越冬蜜蜂在经受冬季低温制约的不利环境下，体内的保护酶系统受到了激活，对机体的氧化应激做出了一定的适应性改变，形成了响应低温逆境的应答机制。胡双庆等(2019)在菲和铬复合胁迫对蜓蚓抗氧化酶活性及其功能基因表达的影响研究中发现，蜓蚓抗氧化酶活性与其功能基因表达之间总体表现出正相关性，认为功能基因表达可以作为一种重要的生物标志物。夏振宇等(2019)对低温胁迫下越冬期中华蜜蜂体内抗氧化指标及耐寒基因表达影响进行研究发现，耐寒基因TPS和SOD表达上调，CAT表达下调，提示中华蜜蜂对低温胁迫存在耐寒响应的生理机制，认为中华蜜蜂体内抗氧化酶系统存在一定的平衡机制，在机体面对外界不良环境时协同发挥作用，与本研究的结论一致。另一方面，越冬中期是酶活性变化和基因表达的显著变化时期，在养蜂生产上应特别注意对越冬中期蜂群的管理和保护。在整个越冬历期中，越冬中期较前期和后期的气温最低，是蜜蜂群体经历低温冷伤害最为严重的阶段，这是导致越冬中期多数抗氧化酶活性及其基因表达达到最低值的原因。

此外，同为耐寒性突出表现的优异蜂种，欧洲黑蜂和新疆黑蜂在越冬期间的抗氧化酶活性变化规律和抗氧化功能基因表达模式上表现出总体的一致性。新疆黑蜂在品种形成的过程中有欧洲蜜蜂血统的渗入，在历史上对低温极端环境有良好的适应性，具有相同mRNA量表达规律的抗氧化酶基因，可以为揭示蜜蜂体内抵御低温的耐寒机理研究提供新线索，有助于理解它们在东北当地气候、蜜源等生态条件下的产生的环境适应性，进而为揭示蜜蜂耐寒分子机制和抗寒蜂种的选育提供基础的研究数据。

许多生态学和生理学研究已经确定脂质储存和代谢是昆虫在越冬期和低温环境下生存的必要条件(Tothetal.，2009；Wasielewskietal.，2014；Dustyetal.，2016)。在寒冷的冬季，蜜蜂需要更多的能量来维持巢内温度和自身的基础代谢。大量增加的脂质储存被认为是越冬的必要适应，特别是在膜翅目昆虫的成虫中(Tothetal.，2009)。因此，未来的研究工作将更多关注欧洲黑蜂和新疆黑蜂在越冬过程中脂质代谢相关通路中基因的表达变化，以期在全基因组水平上对蜂群越冬基因调控的时间性和特异性提供更多见解。