高效液相色谱法测定感冒灵颗粒中咖啡因、阿司匹林和非那西丁含量

2020-11-11刘彬果叶盛英

中国药业 2020年21期

刘彬果，叶盛英

（中国人民解放军第九八三医院，天津300142）

感冒灵颗粒为中国人民解放军第九八三医院的自制中西药复方制剂，临床应用多年，具有清热解毒功效，用于治疗感冒发热，咽喉疼痛，头痛等，疗效确切。方中蒲公英、败酱草清热解毒，为君药；金银藤、连翘、桔梗为臣药。现有质量标准仅对中药成分进行定性鉴别，无含量测定项[1]。为有效控制该制剂质量，本研究中建立了同时测定咖啡因、阿司匹林及非那西丁含量的高效液相色谱（HPLC）法[2－3]。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），包括OpenLAB CDS色谱工作站；XS105型电子分析天平（上海梅特勒－托利多公司，精度为十万分之一）；KQ－50B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为50 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

阿司匹林对照品（批号为100113－201606），咖啡因对照品（批号为2181807），非那西丁对照品（批号为62－44－2），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为超纯水(自制），其他试剂均为分析纯；感冒灵颗粒（中国人民解放军第九八三医院制剂室提供，批号分别为14290215，15100215，15220215）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax SB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇－0.01 mol／L磷酸二氢钾溶液（40∶60，V／V）；检测波长：265 nm；进样量：10μL；流速：1.0 mL／min；柱温：室温。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取阿司匹林对照品、非那西丁对照品及咖啡因对照品适量，精密称定，加流动相制成含阿司匹林200μg／mL、非那西丁200μg／mL、咖啡因70μg／mL的溶液，即得。

供试品溶液：取样品适量，研细，取0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL流动相，再称定质量，经超声处理（功率为250 W，频率为40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，然后用流动相补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按处方比例制备不含阿司匹林、非那西丁和咖啡因的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别吸取上述3种溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果阴性对照品溶液与对照品溶液相同保留时间处无对应峰出现，表明阴性对照无干扰。详见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：取咖啡因对照品17.5 mg、阿司匹林对照品51.25 mg、非那西丁对照品51.28 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。精密吸取1，2，4，5，6，8，10，20μL，依次进样，按拟订色谱条件测定峰面积，以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，Y咖＝0.042 2 X咖－0.526 66（r＝0.999 9），Y阿＝2.568 5X阿－4.225 6（r＝0.999 7），Y非＝23.37 X非＋45.497（r＝0.999 9）。结果咖啡因、阿司匹林、非那西丁进样量分别在0.35～7.00μg，1.025～20.500μg，1.025～20.510μg（n＝7）范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取同一混合对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次，测定，记录峰面积。结果阿司匹林、咖啡因、非那西丁的RSD分别为2.46%，2.67%，1.13%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为15100215）样品适量，依法制备供试品溶液，室温放置0，1，2，3，4，5，7，12 h时按拟订色谱条件进样测定。结果咖啡因、阿司林和非那西丁的RSD分别为1.72%，2.56%，1.63%(n＝6)，表明供试品溶液在12 h内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为15100215）样品6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果咖啡因、阿司匹林和非那西丁平均含量的RSD分别为1.97%，3.01%，2.26%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为15100215）0.3 g，共5份，精密称定，分别精密加入混合对照品（咖啡因0.25 mg／mL，阿司匹林1.016 mg／mL，非那西丁1.81 mg／mL）各5 mL，精密加入流动相50 mL，称定质量，超声处理（功率为250 W，频率为40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用流动相补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，计算回收率。详见表1。

2.4 样品含量测定

取3批样品适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。计算3批样品中咖啡因、阿司匹林、非那西丁的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 提取方法选择[2－5]

考察超声提取方法中所用的提取溶剂和提取时间等因素，比较分别采用甲醇和流动相提取时的结果，发现采用甲醇提取时，峰形拖尾，无法达到很好的分离效果；当采用流动相进行提取时，提取完全，且峰形较好。考察了不同提取时间（20，30，40 min）的影响，结果表明，超声提取30 min，样品即可提取完全，故选择流动相超声提取30 min。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

表2 3批样品含量测定结果（mg／g）

3.2 检测波长选择

参考文献[6－9]，对3种成分在220～400 nm波长范围进行了紫外光谱扫描，根据各成分的最大吸收值，结果发现，当采用265 nm作为检测波长时，3种成分均有较好的紫外吸收，被测成分检测灵敏。

3.3 流动相选择

参考文献[10－13]，比较了多种流动相体系，分别采用了甲醇－0.01 mol／L磷酸二氢钾溶液、冰醋酸－甲醇溶液（用乙二胺调节pH 3.7）、乙腈－四氢呋喃－冰醋酸－水和甲醇－水，当采用甲醇－水、冰醋酸－甲醇溶液为流动相时，干扰严重，样品稳定性差，基线漂移，无法达到分离要求；当选用甲醇－0.01 mol／L磷酸二氢钾溶液和乙腈－四氢呋喃－冰醋酸－水为流动相时，可满足检测要求。对这2种流动相进行研究，综合考察了样品的稳定性、分离度、峰形、出峰时间、峰形（对称性）、理论板数等因素，最终选择甲醇－0.01 mol／L磷酸二氢钾溶液为流动相，并对其不同比例进行研究，确定甲醇－0.01 mol／L磷酸二氢钾溶液（40∶60，V／V）为流动相。