抗炎退热片高效液相色谱指纹图谱的建立及其7种成分含量测定

2020-11-11肖何芳

中国药业 2020年21期

肖何芳

（中国人民解放军联勤保障部队第九医院，福建福州350000）

抗炎退热片收载于2015年版《中国药典（一部）》，由蒲公英、黄芩2味中药按1∶1加工制备而成，具有清热解毒、消肿散结功效，用于治疗肺胃热盛所致的咽喉肿痛、疮痈疔疖、红肿热痛诸症[1]。方中蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.－Mazz.、碱地蒲公英Taraxacum borealisinense Kitam.或同属数种植物的干燥全草，属药食同源中药材，有抑菌抗炎、利胆保肝、通乳、健脾等药理作用，常用于治疗慢性咽喉炎、乳腺炎、尿路感染等疾病，含有酚酸类、黄酮类、植物甾醇类、香豆素类等多种有效成分，常以绿原酸、咖啡酸及菊苣酸等酚酸类成分作为质量控制的指标性成分[2－4]。黄芩来源于唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类成分是其重要活性成分。具有泻火解毒、清热燥湿、凉血止血、安胎利尿功效[5－6]。目前，多家企业生产的抗炎退热片的质量标准仅对黄芩中的指标成分黄芩苷进行了含量测定，难以全面反映该制剂的内在质量。指纹图谱技术作为多组分复杂样品的质量控制方法，具有整体性和模糊性特点，实现了对待测样品内在化学成分的整体质量和综合评价的全面控制[7－8]。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）指纹图谱技术构建了抗炎退热片的指纹图谱，同时测定了绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素7种成分的含量，并结合聚类分析对其含量测定结果进行综合分析，旨在多角度、多技术、更全面地控制抗炎退热片的质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪，包括2695四元梯度泵，2695自动进样器，2489紫外可见光检测器，Empower3色谱工作站(美国沃特世公司）；AUW－220D型电子天平（日本岛津公司，精度为0.01 mg）；KQ－250DB型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司，功率为500 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号为110753－201817，纯度为96.8%），咖啡酸对照品（批号为110885－201703，纯度为99.7%），菊苣酸对照品（批号为111752－201703，纯度为97.6%），黄芩苷对照品（批号为110715－201821，纯度为95.4%），汉黄芩苷对照品（批号为112002－201702，纯度为98.5%），黄芩素对照品（批号为111595－201808，纯度为97.9%），汉黄芩素对照品（批号为111514－201706，纯度为100.0%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，批号为AS192217)，甲醇（色谱纯，批号为MS1923814)，均购自德国Merck公司；磷酸（分析纯，批号为20181117，西陇科学股份有限公司）；试验用水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；抗炎退热片[天津美伦医药集团有限公司，批号分别为20180123（S1），20180219（S2），20180317（S3），20180421（S4），20180519（S5），20180614（S6），20180908（S7），20181015（S8），20181103（S9），171027（S10），171205（S11），规格为每片0.25 g]。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[9－12]与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）－0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min时8%A，10～22 min时8%A→35%A，22～30 min时35%A→48%A，30～45 min时48%A→88%A，45～60min时88%A→8%A)；流速：0.85mL／min；检测波长：328 nm（0～30 min，绿原酸、咖啡酸、菊苣酸），280 nm（30～60 min，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素）；柱温：40℃；进样量：10μL。分别精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液各10μL，按拟订色谱条件进样，7种成分间的分离度均大于1.5，拖尾因子均小于1.29，理论板数按绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰计均大于8 600。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别取绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，精密称定，用50%甲醇溶解，超声处理，制成质量浓度分别为1.689 5，3.645 3，3.202 9，5.916 3，4.010 7，3.182 6，1.701 4 mg／mL的混合对照品贮备液。

供试品溶液：取样品20片，除去糖衣，研细，取约1.0 g，精密称定，置50 mL棕色容量瓶中，加入35 mL 50%甲醇溶液，室温超声处理（功率为400 W，频率为40 kHz）40 min后取出，放冷至室温，用50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。室温避光保存。

2.3 HPLC方法学考察及指纹图谱建立

精密度试验：取样品[批号为20181015（S8）]，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件连续进样5次，每次10μL，记录色谱图，以黄芩苷为参比峰。结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为0.77%和0.24%(n＝5)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品[批号为20181015（S8）]，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别于0，5，10，15，20，24 h时进样分析，记录色谱图，以黄芩苷为参比峰。结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为1.08%和0.43%(n＝6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取样品[批号为20181015（S8）]，依法平行制备供试品溶液6份，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图，以黄芩苷为参比峰。结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为1.05%和0.55%(n＝6)，表明方法重复性良好。

指纹图谱的建立及相似度分析：取样品（S1～S11），依法分别制备11批供试品溶液，按拟订色谱条件对11批样品进行检测分析，记录色谱数据，将11批样品的色谱数据的AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）软件进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1。1～11号样品与对照图谱的相似度分别为0.997，0.965，0.996，0.949，0.975，0.961，0.929，0.998，0.939，0.957，0.981，均大于0.92，质量稳定，符合指纹图谱相关要求。

共有峰指认：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）软件对11批样品的HPLC图谱进行比较和分析。结果11批样品共有19个共有峰，通过与混合对照品溶液图谱保留时间和紫外光谱图对照，指认出2号峰为绿原酸，3号峰为咖啡酸，5号峰为菊苣酸，12号峰为黄芩苷，14号峰为汉黄芩苷，17号峰为汉黄芩素，18号为黄芩素。在共有峰中，以12号峰的面积最大且峰位居中，分离完全，稳定性较好，设为参照峰（S），计算其他共有峰对11号峰的相对保留时间和相对峰面积及其RSD。详见表1。

图1 高效液相色谱指纹图谱及色谱图

2.4 多指标成分含量测定

2.4.1 方法学考察

线性关系考察：精密量取2.2项下混合对照品贮备液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置100 mL容量瓶中，以50%甲醇稀释至刻度，制得系列对照品溶液，室温避光保存，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图。以对照品溶液质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程及相关系数(r)，详见表2。结果表明，7种成分质量浓度在各自范围内与峰面积线性关系良好。分别取峰面积信噪比（S／N）＝10和S／N＝3时的混合对照品溶液质量浓度考察定量限和检测限，结果见表2。

表1 11批样品HPLC图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积

表2 7种指标成分的线性关系考察结果及定量限和检测限（n＝6）

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品贮备液10μL，按拟订色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.44%，0.56%，0.67%，0.51%，0.72%，0.64%，0.69%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品(批号为20181015)，依法制备供试品溶液，分别于0，4，8，12，20，24 h时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的RSD分别为0.61%，0.74%，0.81%，0.52%，0.90%，0.65%，0.73%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号为20181015）样品，共6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算7种成分的含量及其RSD。结果绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的平均含量分别为0.936 1，1.883 4，1.669 5，3.811 7，2.200 6，1.673 2，0.860 2 mg／g，RSD分别为0.78%，0.89%，1.05%，0.75%，0.91%，0.95%，1.02%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批（批号为20181015）样品6份，每份0.5 g，精密称定，分别置50 mL棕色容量瓶中并精密加入2.2项下混合对照品贮备液0.3 mL，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，计算各成分的加样回收率。结果见表3。

表3 抗炎退热片7种成分加样回收试验结果（n＝6）

2.4.2 样品含量测定

取S1～S11号样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，按外标法分别计算各成分的含量。结果见表4。11批样品中，绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量分别为0.930 1～0.938 8 mg／g，1.878 6～1.887 2 mg／g，1.661 4～1.673 9 mg／g，3.807 6～3.815 8 mg／g，2.196 9～2.206 1 mg／g，1.668 2～1.679 9 mg／g，0.855 9～0.865 8 mg／g。

2.5 聚类分析

根据系统聚类分析（CA）分到同一类的样品具有很大的相似性，而不同类间的样品会有相异性[13－14]。采用SPSS 22.0统计学软件，应用组间均联法，以欧氏距离平方为测度，采用系统聚类分析法进行模式识别分析。聚类分析树状图见图2。可见，类间距离为15～25时，11批样品被分成两大类：样品S2，S7，S6，S10，S11，S4，S9，S5为一类，与对照指纹图谱相似度在0.929～0.981之间；样品S1，S8，S3为一类，相似度与对照指纹图谱大于0.995。聚类分析结果与相似度结果基本一致。这可能是由于药材原材料质量、产地及生产工艺等存在差异所致。

2.6 含量测定结果分析

将11批样品中7种成分的含量测定结果输入SPSS 22.0统计学软件的“描述性分析”，结果见表5及图3。可见，7种成分含量标准差值与平均值无明显差异，即11批样品中7种成分含量无异常值，表明样品抗炎退热片产品性质稳定。

3 讨论

为实现绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量的同时测定，本研究中采用DAD在200～400 nm波长范围内扫描，为使各成分均在其最大吸收波长处进行测定，采用在不同时段切换不同检测波长的方法，即0～30 min检测波长为328 nm，检测绿原酸、咖啡酸及菊苣酸；30～60 min检测波长为280 nm，检测黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素。考察流动相时，选用了乙腈－水系统、甲醇－水系统、乙腈－磷酸系统，发现在流动相中加入一定比例的酸有助于改善峰形；也比较了乙腈－磷酸（0.1%，0.3%，0.5%）溶液、甲醇－磷酸（0.1%，0.3%，0.5%）溶液进行梯度洗脱。结果表明，以乙腈－0.5%磷酸盐水溶液为流动相可得到HPLC色谱图峰数量最多且分离度好。曾比较不同提取溶剂（甲醇、乙醇、80%甲醇、50%甲醇）、提取方式（浸渍过夜、加热回流、超声提取）、提取时间（40，35，30 min）的效果，结果以50%甲醇溶液超声提取40 min时，各待测成分提取率高。