疱疹膏皮肤用药安全性实验研究

沈德新 李登攀 秦臻 岳玮 屈俊 初霞

[摘要] 目的 觀察疱疹膏皮肤用药的安全性。 方法 选用健康成年新西兰兔8只，应用随机数字表法分为完整皮肤组和破损皮肤组，每组4只，采用同体左右对照法分组涂布疱疹膏和疱疹膏基质（每只0.5 g）进行皮肤刺激试验，14 d后对给药皮肤进行组织病理学检查;选用健康成年豚鼠40只，应用随机数字表法分为疱疹膏组、基质组、二硝基氯苯组，疱疹膏组20只，其余组各10只，分组涂布疱疹膏（每只0.2 g）、疱疹膏基质（每只0.2 g）、2，4-二硝基氯苯（每只0.2 mL）进行皮肤致敏试验，2个试验均以红斑和水肿情况为评价指标;选用新西兰兔24只，应用随机数字表法分为疱疹膏组、基质组、空白对照组，每组8只，分组涂布10 g/kg、2 g/kg、2 mL/kg的疱疹膏、疱疹膏基质、生理盐水进行皮肤急性毒性试验，观察各组新西兰兔14 d内体质量变化、中毒反应及死亡情况。给药后第14天，对全部新西兰兔进行大体解剖，如有毒性反应和大体剖检异常，则进行病理组织学检查。 结果 疱疹膏对新西兰兔完整皮肤和破损皮肤均无刺激作用，皮肤组织病理学检查正常;疱疹膏对豚鼠无皮肤过敏反应，致敏强度评分均为0;对新西兰兔未见急性毒性反应，解剖后组织器官未见明显异常，体重增长符合生长规律。疱疹膏组与空白对照组比较，新西兰兔体重差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 疱疹膏无皮肤刺激性、过敏性、急性毒性，局部皮肤用药安全性良好，可以应用于临床。

[关键词] 疱疹膏;皮肤刺激性;过敏性;急性毒性试验;安全性

[中图分类号] R285          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）09（a）-0024-05

[Abstract] Objective To observe the safety of skin medication of herpes ointment. Methods Eight healthy adult New Zealand rabbits were selected and divided into intact skin group and damaged skin group by random number table method， four rabbits in each group. The skin irritation test was carried out by coating herpes ointment and herpes ointment matrix （0.5 g each） with the homologous control method， and the skin was administered for histopathological examination 14 days later. Forty healthy adult guinea pigs were selected and divided into herpes ointment group， matrix group， dinitrochlorobenzene group by random number table method， twenty in herpes ointment group and ten in other groups. The skin sensitization test was carried out by coating herpes ointment （0.2 g each）， herpes ointment matrix （0.2 g each）， and 2，4-dinitrochlorobenzene （0.2 mL each）. Erythema and edema were used as evaluation indexes in two tests. Twenty-four New Zealand rabbits were selected and divided into herpes ointment group， matrix group and blank control group by random number table method. Each group had eight rabbits. Acute skin toxicity tests were carried out on New Zealand rabbits coated with 10 g/kg， 2 g/kg， 2 mL/kg herpes ointment， herpes ointment matrix and normal saline in groups， and the changes of body mass， toxic reaction and death of rabbit in each group were observed within 14 days. On the 14th day after dosing， general anatomy was performed on all New Zealand rabbits， and histopathological examination was performed if there were any toxic reactions and general anatomy abnormalities. Results Herpes ointment had no irritating effect on intact and damaged skin of New Zealand rabbits， and the histopathological examination of skin was normal. Herpes ointment had no skin allergic reaction to guinea pigs， and the sensitization intensity score was 0; there was no acute toxicity reaction to New Zealand rabbits， no obvious abnormalities were found in tissues and organs after dissection， body weight growth was consistent with the growth law. Compared with the blank control group， there was no significant difference in the weight of New Zealand rabbits of the herpes ointment group （P > 0.05）. Conclusion Herpes ointment has no skin irritation， allergy， or acute toxicity. The topical skin medication is safe and can be used for clinical applications.

[Key words] Herpes ointment; Skin irritation; Allergy; Acute toxicity; Safety

疱疹膏是解放军联勤保障部队第九八八医院（以下简称“我院”）根据民间验方，结合多年治疗带状疱疹的临床经验研制出的一种外用制剂，具有清热解毒，解毒疗疮的功效，临床主要以外涂透皮给药治疗带状疱疹。疱疹膏可经皮肤直接吸收进入患处，抑制水痘-带状疱疹病毒复制，缓解疼痛，减轻炎性渗出，促进疱疹愈合，是一种理想的治疗带状疱疹外用剂。为评估其安全性，依据中华人民共和国国家职业卫生标准（GBZ）[1]，进行了疱疹膏皮肤刺激性、过敏性和急性毒性试验，并对该药进行客观评价，为临床使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

疱疹膏、疱疹膏基质为我院制剂室试制，批号20200310，规格：30 g/盒，浓度0.2 g/g（每克含生药0.2 g）;阳性致敏药物：2，4-二硝基氯苯，日本东京化成工业株式会社，批号WT6CA-QB;Sartorius电子天平，型号：BT125D，精度：0.01 mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 实验动物

健康10～14周龄新西兰兔32只，体重2～3 kg;8～12周龄白色豚鼠40只，体重250～300 g;实验动物均为清洁级，雌雄各半，雌性无孕，购自西安益丰达生物科技有限公司动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（陕）2017-002。动物实验室符合国家相应规定，实验期间将动物置于恒温、恒湿动物房，实验室分笼喂养，自由进食、饮水，适应环境3 d后方可进行实验。本试验经我院医学伦理委员会审核通过，符合《实验动物福利伦理审查指南》[2]要求，尽量减少使用的动物数量和可能遇到的任何痛苦。

1.3 方法

1.3.1 皮肤刺激性试验

取符合要求的健康成年新西兰兔8只，应用随机数字表法分为两组，即完整皮肤组和损伤皮肤组，每组4只，采用同体左右侧自身比较法。实验前24 h将新西兰兔背部两侧脱毛，范围为4 cm×4 cm，去毛区皮肤无损伤者留作完整皮肤试验;去毛区皮肤用刀片作多处“#”字形划破至渗血为度，留作损伤皮肤试验。左侧正常皮肤及破损皮肤脱毛区均涂以0.5 g疱疹膏基质作为空白对照，右侧均涂以受试药物疱疹膏0.5 g，用1层纱布和一层蜡纸覆盖，再用无纺布空贴及无刺激性胶布加以固定。4 h后去除覆盖物，用温水清除残留受试样品。每天同一方法，同一时间给药1次，持续给药7 d。在每次去除受试物后1 h及再次涂敷前观察、记录皮肤是否有红斑、水肿、出血点等情况及其发生和消退时间。末次贴敷后，在去除受试物后1、24 h，2、3、4、5、6、7 d观察并记录受试部位有无红斑和水肿，并依据《GBZ/T240.6-2011化学品毒理学评价程序和试验方法 第6部分：急性皮肤刺激性/腐蚀性试验》[3]皮肤刺激反应实验评分标准计算反应积分并分级，第14天实验结束后，作受药部位皮肤组织病理学检查。

皮肤刺激反应评分标准[3]：无红斑记0分，轻度红斑（勉强可见）记1分，中度红斑（明显可见）记2分，重度红斑记3分，紫红色红斑到轻度焦痂记4分;无水肿记0分，轻度水肿（勉强可见）记1分，中度水肿（明显隆起）记2分，重度水肿（皮肤隆起1 mm，轮廓清楚）记3分，严重水肿（皮肤隆起1 mm以上并有扩大）记4分。皮肤刺激反应评分均值=（红斑和焦痂总分+水肿总分）/实验动物总数，每组的评分以不同观察时间的最高值计。皮肤刺激强度分级标准[3]：评分<0.5，无刺激性;评分0.5～<2.0，轻度刺激性;评分2.0～6.0，中度刺激性;评分>6.0，强刺激性。

1.3.2 主动皮肤过敏试验

取符合要求的豚鼠40只，雌雄各半，试验前24 h将其背部左侧去毛，去毛范围为3 cm×3 cm。应用随机数字表法分为三组，即基质组、疱疹膏组、二硝基氯苯组，疱疹膏组20只，其余组各10只。

1.3.2.1 皮肤致敏接触  分别在相应组别的豚鼠的左侧脱毛区均匀涂布疱疹膏基质（0.2 g/只）、疱疹膏（0.2 g/只）、1% 2，4-二硝基氯苯溶液（0.2 mL/只），6 h后，移去敷贴物，温水洗去受试样品，观察皮肤红斑和水肿情况。第7、14天各组豚鼠采用同样的方法重复接触致敏。

1.3.2.2 皮肤激发接触  末次致敏接触后14 d，用与致敏接触相同的方法，将疱疹膏基质（0.2 g/只）、疱疹膏（0.2 g/只）、0.1% 2，4-二硝基氯苯溶液（0.2 mL/只），分别涂在相应组别的豚鼠右侧背部3 cm×3 cm的脱毛区（试验前24 h去毛），6 h后去除受试样品，清洗方法同前。在0、24、48、72 h分别观察和记录皮肤红斑和水肿情况，同时观察动物是否出现哮喘、站立不稳和休克等严重全身过敏反应。根据红斑和水肿情况计算反应积分并分级，具体评分标准同“1.3.1”项。每组的致敏反应积分=（红斑和焦痂形成总分+水肿形成总分）/动物总数。当受试样品组豚鼠皮肤反应积分≥2时，判為皮肤致敏反应阳性，并计算致敏率及致敏强度。致敏率=发生过敏反应动物数/动物总数×100%。致敏强度：致敏率<9%，Ⅰ级致敏度，弱致敏性;9%～28%，Ⅱ级致敏度，轻度致敏性;29%～64%，Ⅲ级致敏度，中度致敏性;65%～80%，Ⅳ级致敏度，强致敏性;≥81%，Ⅴ级致敏性，极强致敏性;其中Ⅰ级致敏度无意义，实际使用中无致敏危险[4]。

1.3.3 局部皮肤急性毒性试验

取符合要求的新西兰兔24只，应用随机数字表法分为三组，分别为空白对照组、基质组、疱疹膏组，每组8只。给药前24 h同前法备皮，去毛面积相当于体表面积的10%左右，约150 cm2。依据《GBZ/T240.3-2011化学品毒理学评价程序和试验方法 第3部分：急性经皮毒性试验》[5]中规定，受试样品剂量达到2 g/kg仍不出现实验动物死亡时，则不需要再进行更高剂量试验，为实际无毒级。以此标准，疱疹膏的浓度为0.2 g/g，新西兰兔需要的最大生药剂量=2 g/kg，那么，新西兰兔需要的疱疹膏最大剂量=2 g/kg×1g÷0.2 g=10g/kg。采用24 h内2次给药方式，每次疱疹膏以最大剂量10 g/kg，基质2 g/kg，生理盐水2 mL/kg 均匀涂抹在相应组别的受试皮肤区，24 h取下固定物和覆盖物，用温水洗去皮肤上的残留受试样品。观察1、24、48、72 h直至14 d动物的行为活动，体征，用药部位皮肤反应，进食排泄，眼和黏膜变化，呼吸和中枢神经系统变化，四肢活动及其他的中毒表现，观察动物死亡情况。并在给药前、给药后第4、7、10、14天，对新西兰兔体重进行检测，统计分析疱疹膏对体重有无影响。试验结束后将全部新西兰兔静脉注射丙泊芬（1.5 mL/kg）麻醉后进行大体解剖学检查，如有毒性反应或剖检脏器出现异常，则进行病理学检查。

1.4 统计学方法

应用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资料用均值±标准差（x±s）表示，重复测量资料数据组间总体比较采用重复测量方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，组内各时间点之间的比较采用Bonferroni法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皮肤刺激性试验结果

疱疹膏及基质对完整皮肤的刺激性各组评分均为“0”;对破损皮肤，疱疹膏组及基质组在1、24 h平均反应分值虽有轻微增加，但2 d内均恢复正常，两组评分均值均< 0.5。见表1。

2.2 主动皮肤过敏试验结果

经过72 h的观察，基质组及疱疹膏组均未见过敏反应，皮肤均光滑，未见红斑、鳞屑、水肿及焦痂。二硝基氯苯组所有豚鼠均出现不同程度的红斑、厚层鳞屑、水肿或焦痂，并且大多有皮损出现，表现出极强的致敏性，致敏率为100%。见表2、图1。

2.3 局部皮肤给药急性毒性试验

疱疹膏最大耐受量皮肤给药急性毒性试验中，各组新西兰兔一般状态良好，其行为、外观、饮食、对刺激的反应、分泌物、排泄物等均未见明显异常。各组新西兰兔亦未出现全身中毒表现和死亡情况，给药后第14天对全部新西兰兔进行解剖，经肉眼观察未见明显组织、器官异常，亦未见明显毒理性反应改变。经重复测量方差分析，时间点比较差异有统计学意义（P < 0.05），组间比较及交互作用差异均无统计学意义（P > 0.05）。提示三组新西兰兔体重总体及各测量时间点体重比较，差异均无统计学意义，但三组体重随时间稳定增长。进一步两两比较，组内比较：与本组第0天比较，第7、10、14天三组体重明显增加，差异均有统计学意义（P < 0.05），且第14天体重高于第7天，差异有统计学意义（P < 0.05）;组间比较：三组同期各时间点两两比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。见表3。

2.4 皮肤组织病理学结果

除损伤皮肤组表皮可见机械损伤旧痕外，其余各组表皮完整，颗粒层、棘层厚度正常，皮脂腺、毛囊及毛发结构正常，皮下未见显著的炎症细胞浸润和组织充血、出血、水肿、变性、坏死等病理性改变。见图2。

3 讨论

带状疱疹是一种常见的皮肤疾病[6-9]，好发于成人[10-12]，主要由水痘-带状疱疹病毒（VZV）引起[13-15]。当细胞免疫因衰老、免疫抑制障碍或药物治疗而降低时，带状疱疹的发生率增加[16-19]。带状疱疹可导致患者疼痛剧烈，寝食难安[20-23]，严重影响患者的生活质量[24-28]。为快速缓解带状疱疹患者疼痛，短期促使疱疹痊愈，我院制剂中心开发研制出用于治疗带状疱疹的外涂制剂疱疹膏。为尽快实现临床推广应用，需对疱疹膏的安全性进行评估。

依据GBZ[1]的相关要求及标准选取新西兰兔进行皮肤刺激性实验。经观察，完整皮肤组涂疱疹膏后局部皮肤于清除受试物后1、24 h，2、3、4、5、6、7 d的8个时间段里，均未见红斑或水肿出现，皮肤形态与基质组一样，两组的平均反应刺激强度分值均为0;损伤皮肤疱疹膏组及基质组局部皮肤于清除受试物后1、24 h，均有1个皮肤出现免强可见的红斑，2 d内均恢复正常，两组平均反应刺激强度分值均< 0.5，其余组别除了刀片划伤正常皮肤后出现的暗红色结痂外，均未见红斑或水肿出现。根据GBZ皮肤刺激强度分级标准[4]：评分< 0.5，无刺激性。局部皮肤病理学检查结果正常。以上结果提示疱疹膏与疱疹膏基质均对正常皮肤和破损皮肤无刺激性。

在致敏性试验中，阳性对照二硝基氯苯组全部豚鼠均出现不同程度的红斑、厚层鳞屑、水肿或焦痂，并且大多有皮损出现。由于致敏率=发生过敏反应动物数/动物总数×100%，所以，二硝基氯苯组的致敏率为100%;根据致敏强度分级标准[4]：当致敏率≥81%时，其致敏强度为Ⅴ级，为极强致敏性。而疱疹膏组及基质组豚鼠皮肤完整、光滑，无红斑、鳞屑、水肿及焦痂，致敏率为0，结果提示疱疹膏及基质对皮肤无致敏性。

在局部给药急性毒性试验中，为保证足够的受试剂量，疱疹膏仅以最大给药量2 g生药/kg体重进行试验测定，给药后1、24、48、72 h及第14天各组新西兰兔一般状态良好，其行为、外观、饮食、对刺激的反应、分泌物、排泄物等未见明显异常;皮膚未见红斑、水肿;经重复测量方差分析，时间点比较差异有统计学意义（P < 0.05），组间比较及交互作用差异均无统计学意义（P > 0.05）。提示三组新西兰兔体重总体比较及各测量时间点体重比较，差异无统计学意义，但三组体重随时间稳定增长。各组新西兰兔亦未出现全身中毒表现和死亡情况;各重要脏器未见明显病理性损伤及毒理性反应改变，提示疱疹膏皮肤急性毒性试验是安全的，无明显的急性毒性。

本试验结果显示，疱疹膏皮肤给药无显著毒性反应、无皮肤刺激性、无过敏性，安全性较高，符合外用制剂的安全性要求，可以进一步进行临床研究和推广。

[参考文献]

[1]  中华人民共和国卫生部.GBZ/T240-2011中华人民共和国国家职业卫生标准[S].北京：人民卫生出版社，2011.

[2]  全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC 281）.实验动物福利伦理审查指南：GB/T 35892-2018[S].北京：中国标准出版社，2018.

[3]  中华人民共和国卫生部.GBZ/T240.6-2011化学品毒理学评价程序和试验方法 第6部分急性皮肤刺激性/腐蚀性试验[S].北京：中国标准出版社，2011：1-8.

[4]  中华人民共和国卫生部.GBZ/T240.7-2011化学品毒理学评价程序和试验方法第7部分：皮肤致敏试验[S].北京：中国标准出版社，2011：1-12.

[5]  中华人民共和国卫生部.GBZ/T240.3-2011化学品毒理学评价程序和试验方法第3部分：急性经皮毒性试验[S].北京：中国标准出版社，2011：1-8.

[6]  Schmader K. Herpes Zoster [J]. Clin Geriatr Med，2016， 32（3）：539-553.

[7]  张艳，辛随成.叩刺放血疗法治疗急性期带状疱疹的临床观察[J].中国民间疗法，2020，28（6）：115-117.

[8]  Saguil A，Kane S，Mercado M，et al. Herpes Zoster and Postherpetic Neuralgia： Prevention and Management [J]. Am Fam Physician，2017，96（10）：656-663.

[9]  袁媛，黄文祥，贾蓓.带状疱疹的临床特征及与他汀类药物关系的回顾性研究[J].中国全科医学，2018，21（21）：2587-2591.

[10]  李福，张晓琳.单方外敷联合中药内服治疗带状疱疹验案举隅[J].中医临床研究，2020，12（7）：100-102.

[11]  胡明岸，刘迈兰，孙永康，等.姜京明教授闪火灸法结合针刺治疗带状疱疹经验[J].中医研究，2020，33（5）：48-50.

[12]  郭伟伟，袁涛忠，孙玉丽，等.苗医对带状疱疹的认知[J].中国民族医药杂志，2020，26（3）：45-47.

[13]  Watanabe D. Herpes Zoster Vaccine [J]. Uirusu，2018，68（1）：21-30.

[14]  Wollina U. Herpes zoster [J]. MMW Fortschr Med，2018， 160（1）：35-42.

[15]  Bolton L. Herpes Zoster（Shingles）[J]. Wounds，2018，30（5）：144-146.

[16]  皇甫佳欣，沈德新.帶状疱疹后遗神经痛的中西医治疗进展[J].中国医药导报，2020，17（12）：65-68.

[17]  曹立东.神经阻滞联合聚肌胞治疗带状疱疹及后神经痛的临床疗效[J].中国现代医生，2018，56（19）：78-81.

[18]  Marra F，Parhar K，Huang B，et al. Risk Factors for Herpes Zoster Infection：A Meta-Analysis [J]. Open Forum Infect Dis，2020，7（1）：ofaa005.

[19]  Dayan RR，Peleg R. Herpes zoster-typical and atypical presentations [J]. Postgrad Med，2017，129（6）：567-571.

[20]  许敏华，朱延涛，贾黎华.中医药治疗带状疱疹临床研究进展[J].新中医，2019，51（6）：33-36.

[21]  王宏蕾，张楠，孙国强，等.白蛇合剂离子导入联合半导体激光治疗急性期带状疱疹神经痛的临床研究[J].中医药导报，2019，25（20）：106-108，111.

[22]  王龙，陶梦友，项琼.梅花针叩刺拔罐联合七叶神龙膏外敷治疗急性带状疱疹33例[J].中国民间疗法，2020， 28（1）：34-35.

[23]  陈盼，肖礼祖.带状疱疹性神经痛病人的焦虑抑郁与激素水平研究现状[J].中国疼痛医学杂志，2018，24（5）：378-382.

[24]  区颖豪，梁丽婷，伍冬妮.灯芯灸治疗急性期带状疱疹临床观察[J].光明中医，2019，34（18）：2843-2845.

[25]  杨剑，张永刚.自拟清热利湿饮配合针灸治疗带状疱疹临床研究[J].陕西中医药大学学报，2018，41（5）：77-79.

[26]  孙晓辉.疏风解毒汤配合西药治疗带状疱疹的疗效及对后遗神经痛的影响[J].中国医药科学，2020，10（7）：19-22.

[27]  马立娟，赵沿懿，顾礼忠.大剂量伐昔洛韦治疗带状疱疹有效性和安全性的临床观察[J].中国处方药，2020， 18（3）：94-96.

[28]  葛鑫，潘启红，江从军.伐昔洛韦配合甲钴胺治疗带状疱疹的效果观察[J].海峡药学，2020，32（4）：186-187.

（收稿日期：2020-06-01）