蛇葡萄素对实验性结肠炎大鼠Treg/Th17细胞分化的影响

王超 王晓娟 朱美荣 万玉刚

[摘要] 目的 探討蛇葡萄素对实验性结肠炎大鼠Treg/Th17细胞分化的影响。 方法 48只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为对照组，模型组、高、中、低剂量组和柳氮磺吡啶组，每组8只。除对照组外，其余5组大鼠均使用三硝基苯磺酸建立实验性结肠炎模型。造模3 d后，药物治疗7 d，高、中、低剂量组大鼠分别灌胃给予500、250、125 mg/（kg·d）蛇葡萄素，柳氮磺吡啶组灌胃柳氮磺吡啶100 mg/（kg·d），对照组灌胃定量生理盐水。比较6组转化生长因子-β1（TGF-β1）、白细胞介素-10（IL-10）、IL-17、叉头转录因子3（Foxp3）、信号转导与转录活化因子5（STAT5）、维甲酸相关孤核受体γt（RORγt）、STAT3、IL-35表达水平。 结果 模型组病理损伤评分明显高于对照组（P < 0.05）;高、中剂量组和柳氮磺吡啶组病理损伤评分低于模型组（均P < 0.05）。模型组TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表达水平低于对照组，IL-17、RORγt、STAT3表达水平高于对照组（均P < 0.05）。高、中、低剂量组和柳氮磺吡啶组TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表达水平高于模型组，IL-17、RORγt、STAT3表达水平均低于模型组（均P < 0.05）。 结论 蛇葡萄素可以调节实验性结肠炎大鼠Treg/Th17细胞分化，增强细胞功能。

[关键词] 蛇葡萄素;实验性结肠炎;白细胞介素;转录因子;调节性T细胞;辅助性T-17细胞

[中图分类号] R574.62          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）09（a）-0019-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Ampelopsin on the differentiation of Treg/Th17 cells in experimental colitis rats. Methods Forty-eight male SD rats were divided into control group， model group， high dose group， medium dose group， low dose group and Sulfasalazine group by random number table method， with eight rats in each groups. Except for control group， the other five groups of rats were used Trinitrobenzene Sulfonic Scid to establish experimental colitis model. After three days of modeling， drug treatment was given for seven days. Rats in high， medium， and low dose groups were given 500， 250 and 125 mg/（kg·d） of Ampelopsin respectively， and Sulfasalazine group was given 100 mg/（kg·d） of Sulfasalazine， and control group was given quantitative normal saline. The levels of transformed growth factor-β1 （TGF-β1）， interleukin-10 （IL-10）， IL-17， forkhead box P3 （Foxp3）， signal transducers and activators of transcription 5 （STAT5）， retinoic related orphan receptor γt （RORγt）， STAT3 and IL-35 in six groups were compared. Results The pathological injury score of model group was higher than that of control group （P < 0.05）; and the pathological injury scores of high， medium dose groups and Sulfasalazine group were lower than those of model group （all P < 0.05）. The expression levels of TGF-β1， IL-10， IL-35， Foxp3 and STAT5 of model group were lower than those of control group， while the expression levels of IL-17， RORγt and STAT3 were higher than those of control group （all P < 0.05）. The expression levels of TGF-β1， IL-10， IL-35， Foxp3 and STAT5 of high， medium， low dose groups and Sulfasalazine group were higher than those of model group， while the expression levels of IL-17， RORγt and STAT3 were lower than those of model group （all P < 0.05）. Conclusion Ampelopsin can regulate Treg/Th17 cell differentiation and enhance cell function in experimental colitis rats.

[Key words] Ampelopsin; Experimental colitis; Interleukin; Transcription factor; Regulatory T cells; Helper T-17 cells

溃疡型结肠炎（UC）是一种特发性慢性炎症，与遗传、菌群失调和免疫炎症损伤等有关[1-2]。调节性T细胞（Treg）功能紊乱在UC发病中起到重要作用[3-4]，表现为Treg细胞比例下降，白细胞介素（IL）-17水平升高[5]。转化生长因子-β1（TGF-β1）和IL-10由Treg细胞分泌，可以缓解UC结肠黏膜的炎症反应[6]。此外，还有许多相关因子在UC发病的信号通路中发挥作用[7-8]。通过调节Treg细胞和Th17细胞之间的平衡来治疗免疫炎症性疾病是近年来研究的热点。蛇葡萄素是从蛇葡萄茎叶中分离的一种多酚羟基双氢黄酮醇，具有抗氧化、抗炎和免疫调节作用[9]。张亚兵等[10]发现，蛇葡萄素可以改善实验性结肠炎大鼠血清和结肠组织超氧化物歧化酶水平，并减轻结肠炎性损伤。蛇葡萄素对UC的治疗鲜有报道。本研究检测了蛇葡萄素干预后结肠炎大鼠相关因子的表达水平，探讨蛇葡萄素对Treg/Th17细胞分化的影响，为蛇葡萄素的应用提供理论基础。

1 对象与方法

1.1 实验动物

48只雄性SD大鼠，体重（357.23±21.34）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号：11400700325314，许可证号为SCXK（京）2006～2009。动物饲养环境为：温度（22±2）℃、湿度（50±10）%、明暗周期12 h/12 h，自由摄食和饮水。

1.2 实验分组与处理

采用随机数字表法将48只大鼠随机分为对照组，模型组，高、中、低剂量组和柳氮磺吡啶组，每组8只。除对照组外，其余5组大鼠根据张亚兵等[10]的模型建立标准，用三硝基苯磺酸（201908213，Sigma）建立实验性结肠炎模型。造模成功2 d后，进行药物治疗。高、中、低剂量组大鼠分别灌胃给予500、250、125 mg/（kg·d）蛇葡萄素（张家界至诚生物有限公司，20190211），2次/d[11];柳氮磺吡啶组灌胃柳氮磺吡啶（梯希爱化成发展有限公司，201509191）100 mg/（kg·d），2次/d;对照组灌胃定量生理盐水（石家庄四药有限公司，20190221），2次/d。所有大鼠均干预7 d。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 病理观察及评分  取结肠组织制备石蜡切片，苏木精-伊红（HE）染色。显微镜（CX43，日本Olympus）下表现进行病理评分[12]，包括：无炎症现象0分;极少白细胞浸润1分;少量白细胞浸润2分;较多白细胞浸润，结肠壁增厚3分;结肠全壁有白细胞浸润，杯状细胞丢失，结肠壁增厚4分。

1.3.2 血浆及结肠组织相关蛋白表达水平  酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测血浆中转化生长因子-β1（TGF-β1，2018102312）、IL-10（ 2018102314）、IL-17（2018102321）、叉头转录因子3（Foxp3，2018092234）、信号转导与转录活化因子5（STAT5，20181092252）、維甲酸相关孤核受体γt（RORγt， 2019021671）、STAT3（2018102332）、IL-35（2018102335）水平及结肠黏膜组织TGF-β1、IL-10、IL-17、IL-35水平。试剂盒均购于武汉博士德生物有限公司，严格按照试剂盒说明书操作，ELX 800酶标仪（BioTek公司）检测。

1.3.3 Western blot检测大鼠结肠黏膜Foxp3和STAT5蛋白表达水平  蛋白提取试剂盒（北京百奥莱博生物科技有限公司，019168）从结肠黏膜中提取总蛋白，样品中加入SDS缓冲液煮沸5 min使蛋白变性。经凝胶电泳（SDS-PAGE）后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，孵育一抗，4℃过夜，弃去一抗，TBST洗膜3次，每次5 min。室温孵育二抗2 h，弃去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min。ACCESS2全自动化学发光免疫分析仪（美国Beckman公司）显色，以β-actin作为内参，计算Foxp3和STAT5蛋白条带的灰度比值。

1.3.4 免疫组化SP法检测结肠黏膜RORγt和STAT3蛋白表达水平  制备结肠黏膜石蜡切片，二甲苯脱蜡，乙醇脱水，3%过氧化氢溶液浸泡10 min。将切片在PBS中煮沸30 min，载玻片在5% BSA中培养45 min，4℃下加一抗培养过夜，PBS洗涤3次后加入二抗，37℃下培养45 min。DAB显色，通过复染、脱水、透明和封片等步骤后在显微镜下观察。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色及6组病理评分比较

模型组大鼠镜下可见严重上皮损伤，腺体结构破坏，炎症细胞浸润至黏膜下层。蛇葡萄素和柳氮磺吡啶均可改善上皮损伤，减少炎细胞浸润，保护黏膜肌层，见图1。模型组病理损伤评分高于对照组（P < 0.05），高、中剂量组和柳氮磺吡啶组病理损伤评分低于模型组（均P < 0.05）。见图2。

2.2 ELISA试剂盒检测6组血浆相关蛋白表达水平比较

模型组TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表达水平低于对照组，IL-17、RORγt、STAT3表达水平高于对照组（均P < 0.05）;高、中、低剂量组和柳氮磺吡啶组血浆TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表达水平高于模型组，IL-17、RORγt、STAT3表达水平均低于模型组（均P < 0.05）。见图3。

2.3 ELISA試剂盒检测6组结肠黏膜相关蛋白表达水平比较

模型组TGF-β1、IL-10、IL-35表达水平低于对照组，IL-17表达水平高于对照组（均P < 0.05）;高、中、低剂量组和柳氮磺吡啶组结肠黏膜中TGF-β1、IL-10、IL-35蛋白表达水平高于模型组，IL-17表达水平低于模型组（均P < 0.05）。见图4。

2.4 Western blot检测6组结肠黏膜Foxp3和STAT5表达水平比较

模型组Foxp3和STAT5表达水平低于对照组（均P < 0.05）;高、中、低剂量组和柳氮磺吡啶组Foxp3和STAT5表达水平高于模型组（均P < 0.05）。见图5。

2.5 免疫组化SP法检测6组结肠黏膜RORγt和STAT3表达水平比较

模型组RORγt和STAT3表达水平高于对照组（均P < 0.05）;高、中、低剂量组和柳氮磺吡啶组RORγt和STAT3表达水平低于模型组（均P < 0.05）。见图6、图7。

3 讨论

Treg细胞功能缺陷和Th17细胞增多是UC免疫炎症紊乱的重要原因[13-14]。Foxp3/STAT5通路和RORγt/STAT3通路均涉及Treg/Th17分化的调控[15-16]。在TGF-β1存在的条件下，原始T细胞表面IL-2R与IL-2结合后激活STAT5，促进Foxp3的转录，是原始T细胞分化为Terg并分泌IL-10[17-18]。Foxp3是Treg细胞分化所依赖的转录因子，其表达缺陷可导致肠黏膜发生严重的炎症损伤[19-20]。与Terg类似的是，IL-6/IL-6R/STAT3信号通路和TGF-β1可诱导Th17细胞分化。STAT3的激活又可促进RORγt表达，其是Th17细胞发育重要的转录因子，并且可以促进IL-17的分泌[21-22]。

蛇葡萄素是黄酮类化合物，广泛存在于藤茶、无刺根等植物，具有抗氧化、抗炎和免疫调节的作用[23-24]。既往蛇葡萄素的药效学研究多集中于肿瘤[25]，而鲜有关于UC的报道。张亚兵等[10]发现，蛇葡萄素可以改善实验性结肠炎大鼠血清和结肠组织超氧化物歧化酶水平，并减轻结肠炎性损伤。本研究首次发现，蛇葡萄素在改善实验性结肠炎大鼠黏膜病理损伤的同时，可以下调促炎细胞因子的表达。为了证明蛇葡萄素对Treg/Th17细胞分化的影响，本研究检测了血浆和结肠黏膜中Terg/Th17细胞相关分子的蛋白表达水平。研究结果显示，高、中、低剂量组血浆TGF-β1、IL-10表达水平高于模型组，IL-17表达水平均低于模型组（均P < 0.05）。为了明确蛇葡萄素对Terg/Th17细胞平衡的影响，本研究检测了IL-35、Foxp3/STAT5通路和RORγt/STAT3通路的表达情况。研究结果显示高、中、低剂量组血浆IL-35表达水平高于模型组（P < 0.05），提示蛇葡萄素可促进Terg/Th17细胞分化。本研究结果显示，蛇葡萄素可提高血浆和结肠组织Foxp3和STAT5表达水平，促进Treg细胞分化;下调RORγt和STAT3表达，抑制Th17细胞分化，进一步说明蛇葡萄素对Terg/Th17细胞分化有调节作用。

综上所述，蛇葡萄素可以提高实验性结肠炎大鼠IL-35表达水平，上调Foxp3和STAT5表达，下调RORγt和STAT3表达，进而调节Treg细胞和Th17细胞平衡，促进TGF-β1和IL-10分泌，抑制IL-17分泌，增强细胞功能。总而言之，蛇葡萄素可能通过调控Terg/Th17细胞分化而治疗UC。

[参考文献]

[1]  Reinisch W，Gottlieb K，Colombel JF，et al. Comparison of the EMA and FDA guidelines on ulcerative colitis drug development [J]. Clin Gastroenterol Hepatol，2019，17（9）：1673-1679.e1.

[2]  卢燕，杜静，赵景润，等.雌激素对溃疡性结肠炎患者NF-κB、IL-6及NO表达的影响[J].国际免疫学杂志，2019， 42（1）：38-44.

[3]  Yao J，Wei C，Wang JY，et al. Effect of resveratrol on Treg/Th17 signaling and ulcerative colitis treatment in mice [J]. World J Gastroenterol，2015，21（21）：6572-6581.

[4]  Cui H，Cai Y，Wang L，et al. Berberine regulates Treg/Th17 balance to treat ulcerative colitis through modulating the gut microbiota in the colon [J]. Front Pharmacol，2018，9：571.

[5]  Takahashi M，Nakamura K，Honda K，et al. An inverse correlation of human peripheral blood regulatory T cell frequency with the disease activity of ulcerative colitis [J]. Dig Dis Sci，2006，51（4）：677-686.

[6]  Li M，Eckl J，Geiger C，et al. A novel and effective method to generate human porcine-specific regulatory T cells with high expression of IL-10，TGF-beta1 and IL-35 [J]. Sci Rep， 2017，7（1）：3974.

[7]  Luo CT，Li MO. Transcriptional control of regulatory T cell development and function [J]. Trends Immunol，2013，34（11）：531-539.

[8]  Zongyi Y，Funian Z，Hao L，et al. Interleukin-35 mitigates the function of murine transplanted islet cells via regulation of Treg/Th17 ratio [J]. PLoS One，2017，12（12）：e0189617.

[9]  Tieng FYF，Latifah SY，Md Hashim NF，et al. Ampelopsin E reduces the invasiveness of the triple negative breast cancer cell line，MDA-MB-231 [J]. Molecules，2019，24（14）：2619-2626.

[10]  张亚兵，张莹雯，柯浩亮，等.蛇葡萄素对结肠炎模型大鼠血清和结肠SOD和MDA表达的影响[J].湖北中医药大学学报，2018，20（2）：13-17.

[11]  Osafo N，Obiri DD，Danquah KO，et al. Potential effects of xylopic acid on acetic acid-induced ulcerative colitis in rats [J]. Turk J Gastroenterol，2019，30（8）：732-744.

[12]  赵海梅，鹿秀云，岳海洋，等.黄芪多糖对结肠炎小鼠结肠黏膜JAK/STAT信号的调控作用[J].中国药理学通报，2018，34（1）：145-146.

[13]  Cheng G，Yu A，Malek TR. T-cell tolerance and the multi-functional role of IL-2R signaling in T-regulatory cells [J]. Immunol Rev，2011，241（1）：63-76.

[14]  Bacchetta R，Passerini L，Gambineri E，et al. Defective regulatory and effector T cell functions in patients with FOXP3 mutations [J]. J Clin Invest，2006，116（6）：1713-1722.

[15]  Limagne E，Thibaudin M，Euvrard R，et al. Sirtuin-1 activation controls tumor growth by Impeding Th17 differentiation via STAT3 deacetylation [J]. Cell Rep，2017，19（4）：746-759.

[16]  Ma H，Gao W，Sun X，et al. STAT5 and TET2 Cooperate to Regulate FOXP3-TSDR Demethylation in CD4+T Cells of Patients with Colorectal Cancer [J]. J Immunol Res，2018，2018：6985031.

[17]  Mao QF，Shang-Guan ZF，Chen HL，et al. Immunoregulatory role of IL-2/STAT5/CD4+CD25+Foxp3 Treg pathway in the pathogenesis of chronic osteomyelitis [J]. Ann Transl Med，2019，7（16）：384.

[18]  Peterson LB，Bell CJM，Howlett SK，et al. A long-lived IL-2 mutein that selectively activates and expands regulatory T cells as a therapy for autoimmune disease [J]. J Autoimmun，2018，95：1-14.

[19]  Whiteside TL. FOXP3+Treg as a therapeutic target for promoting anti-tumor immunity [J]. Expert Opin Ther Targets，2018，22（4）：353-363.

[20]  Deng G，Song X，Fujimoto S，et al. Foxp3 Post-translational Modifications and Treg Suppressive Activity [J]. Front Immunol，2019，10：2486.

[21]  Li ZH，Wang YF，He DD，et al. Let-7f-5p suppresses Th17 differentiation via targeting STAT3 in multiple sclerosis [J]. Aging（Albany NY），2019，11（13）：4463-4477.

[22]  Kaufmann U，Kahlfuss S，Yang J，et al. Calcium Signaling Controls Pathogenic Th17 Cell-Mediated Inflammation by Regulating Mitochondrial Function [J]. Cell Metab，2019，29（5）：1104-1118.

[23]  李晨紅，王志正，陈培清，等.蛇葡萄素通过抑制自噬促进结肠癌HCT116细胞凋亡[J].肿瘤，2020，40（4）：245-256.

[24]  周永，郑金英，金小玲，等.PPARγ激活在蛇葡萄素抑制乳腺癌细胞增殖和诱导凋亡中的作用[J].第三军医大学学报，2018，40（13）：1185-1191.

[25]  缪苗苗，吴勇杰，覃红，等.蛇葡萄素钠协同卡铂体外诱导肺癌Lewis细胞凋亡研究[J].中国临床药理学与治疗学，2016，21（11）：1271-1276.

（收稿日期：2020-04-09）