哮喘-慢阻肺重叠患者呼出气冷凝液中8-异前列腺素和白三烯B4与肺功能的关系分析

邢媛媛 陈金亮 陈建荣 吕学东

哮喘和慢性阻塞性肺疾病(简称：慢阻肺)是临床上最常见的呼吸系统疾病[1]。相关研究表明，哮喘和慢阻肺的发病机理、临床症状和诱发因素存在一定的重叠，其被称为哮喘-慢性阻塞性肺重叠综合征(asthma-chronic obstructive pulmonary overlap syndrome，ACOS)[2]。研究发现，ACOS患者生活质量更差，肺功能下降更快、病死率更高[3]。ACOS是进行性疾病，并与肺部异常炎症反应相关，该过程的最终结果是肺实质的破坏和丧失。目前已经采用了各种方法来研究并可能量化ACOS中的炎症，如支气管壁活检、支气管镜检查和支气管肺泡灌洗[4]。然而，这些方法对治疗的反应性滞后，敏感性较低，在预测急性发作方面价值不大。呼出气冷凝液(exhaled breath condensate，EBC)测定方法作为一种非侵入性方法，通过将呼出气体经低温冷却即可形成1～3mL EBC，可用于研究细胞因子成分，有助于判断参与者肺部病理生理的变化[5]。此外，在EBC样本的收集过程不会导致气道炎症状况的任何改变。因此，理论上应用EBC分析ACOS患者气道内炎症反应可协助肺疾病诊断、严重程度分析、治疗效果判断及愈后估计。然而，目前关于EBC在肺部疾病患者中应用的报告相对较少，尤其是ACOS患者。在这项研究中，我们对健康非吸烟志愿者、健康吸烟志愿者和ACOS患者的EBC细胞因子进行测量，并分析细胞因子与ACOS患者肺功能的关系。

资料与方法

一、一般资料

本实验研究于2017年10月至2019年10月在本院呼吸内科进行，共纳入74例ACOS患者作为研究对象。其中40例ACOS稳定期患者和34例ACOS急性加重期患者。ACOS的诊断标准：根据2012年关于慢阻肺重叠表型慢阻肺-哮喘的共识文件[6]，ACOS的诊断依据以下为主要标准：慢阻肺患者的支气管舒张试验结果强阳性(FEV1增加> 400 mL，改善率>15%)；痰嗜酸性粒细胞增多或哮喘的诊断。次要标准：慢阻肺患者总血清IgE升高；过敏史；超过2次支气管舒张试验结果阳性(FEV1增加> 200 mL，改善率>12%)。ACOS诊断需要满足2个主要标准或1个主要和2个次要标准。纳入标准：患者年龄20～70岁，符合诊断标准。排除标准：最近2周内上呼吸道感染；最近一个月使用全身性糖皮质激素；尽管有气流阻塞，但仍可诊断支气管扩张、肺结核、囊性纤维化、弥漫性全细支气管炎、闭塞性细支气管炎；潜在的严重心血管、肝脏、肾脏或造血系统疾病；拒绝合作或无法沟通。同时，选择同期肺功能正常健康体检者45例作为对照，包括24例非吸烟者和21例吸烟者。研究得到本院伦理研究委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

二、肺功能试验

使用肺功能设备(德国JAEGER公司)进行肺功能和支气管舒张试验。肺功能检查由本院肺功能检查实验室的专业人员完成。对每个人重复测试3次，记录第1秒用力肺活量(FEV1)、用力肺活量(FVC)和以及FEV1/FVC。

三、EBC收集和标记

EBC的收集是通过将EcoScreens呼气冷凝液收集装置(德国ViaSys公司)的专用导管插入呼吸机导管的呼气支中进行，持续20 min。利用热湿化器对吸气进行湿化。检查所有EBC样品的淀粉酶活性(α-淀粉酶试剂盒；检出限0.05 mmol/ls；合肥莱尔生物科技有限公司)，以便排除唾液污染。

四、支气管肺泡灌洗

在ACOS患者中，有14例患者由于微生物感染原因进行支气管肺泡灌洗，取一小份(2 mL)作为支气管肺泡灌洗液(BALF)和EBC中细胞因子的比较。所有病例均在支气管镜检查前进行EBC收集。

五、EBC细胞因子测定

采用多重微珠流式荧光免疫分析法(美国Becton-Dickinson公司)分析呼气冷凝液中细胞因子浓度。将具有不同荧光强度的四个珠子群体的混合物，涂上针对8-异前列腺素(8-iso-PG)、肿瘤杀伤因子α(TNF-α)、白三烯B4(LTB4)和白介素-6(IL-6)蛋白的捕获抗体，用2 mL冻干呼吸冷凝液孵育。在BD FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)中，用PE结合检测抗体检测EBC样品中的细胞因子和与捕获珠结合的重组标准物。为了确保用这种市售的系统正确检测细胞因子，在4个样品中研究了试剂量的减少以及对缓冲成分的要求：将规定的细胞因子浓度溶解在水中，并在冷冻保存和冻干前后进行测量，活性损失10.6%。加入1%的牛血清白蛋白，这种损失降低到1.8%。平均批内重复性和批间重复性分别为92.8%(8-iso-PG：89.5%，LTB4：94.5%，IL-6：90.7%，TNF-α：91.6%)和87%(8-iso-PG：82.6%，LTB4：85.7%，IL-6：90.4%，TNF-α：88.9%)。

六、数据处理

采用SPSS 21.0进行统计分析。两组定量数据的比较采用t检验的方法,多组定量数据比较采用单因素方差分析,多组之间两两比较采用SNK-q检验的方法。应用Pearson分析ACOS患者EBC细胞因子与肺功能指标的关系。P0.05被认为差异有显著性。

结 果

一、受试者的基本特征

4组受试者在年龄、BMI和性别方面差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，ACOS稳定期组和ACOS急性加重期组的FEV1、FVC、FEV1/FVC和PaO2均显著降低(P<0.05)(见表1)。

表1 受试者的基本特征

二、EBC中的炎性细胞因子

与对照组相比，ACOS稳定期组和ACOS急性加重期组患者EBC中的8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α水平均显著升高(P<0.05)，其中，ACOS急性加重期组患者EBC中的8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α水平的升高程度显著高于ACOS稳定期组(P<0.05)(见表2)。

表2 各组患者EBC中的炎性细胞因子

三、ACOS患者EBC细胞因子与肺功能的关系

采用Pearson分析ACOS患者EBC细胞因子与肺功能的关系，结果显示，细胞因子8-iso-PG、LTB4、TNF-α水平与FEV1、FVC、FEV1/FVC肺功能指标显著相关(P<0.05)(见表3)。

表3 ACOS患者EBC细胞因子与肺功能的关系

四、吸入皮质类固醇对 ACOS患者EBC细胞因子的影响

研究评估了吸入皮质类固醇对ACOS稳定期组患者和ACOS急性加重期组患者的EBC中细胞因子水平的影响。结果显示，在吸入皮质类固醇后，ACOS稳定期组和ACOS急性加重期组患者的EBC中8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α均显著降低(P<0.05)(见表4)。

表4 吸入皮质类固醇对 ACOS患者EBC细胞因子的影响

五、BALF和EBC细胞因子水平的相关性分析

目前还不清楚BALF与EBC中相同细胞因子的相关性。本研究发现BALF和EBC中的8-iso-PG和LTB4细胞因子水平有显著相关性(P<0.05)(见表5)。

表5 14例ACOS患者亚组中EBC和BALF细胞因子的相关性分析

讨 论

慢性炎症是ACOS的主要特征。这种炎症过程的性质已经通过侵入性的方法，如活检和支气管镜检查进行了彻底的研究[7]。然而，这些方法具有相对的侵袭性，因此近年来更多的研究集中在开发无创技术来评估炎症标志物[8]。目前，EBC中细胞因子的检测已在监测慢阻肺患者炎症过程中得到应用，然而在ACOS患者中的应用十分有限。本研究旨在通过分析健康非吸烟志愿者、健康吸烟志愿者和ACOS患者EBC中的细胞因子谱来表征炎症。这项研究的重要发现是，与稳定期ACOS患者、健康吸烟或不吸烟的志愿者相比，ACOS急性加重期患者的细胞因子水平显著升高。其中急性加重期患者的8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α水平较稳定期ACOS患者升高1.3～2.7倍，与Ayub等使用诱导痰进行分析的结果相似，但是观察到的差异要大很多[9]。这主要是由于本研究采用多重微珠流式荧光免疫分析法，在发现急性与慢性炎症中细胞因子水平差异方面非常敏感[10]。

中性粒细胞是ACOS气道炎症的重要组成部分，在支气管活检标本和支气管肺泡灌洗液中都有发现[11]。LTB4是嗜中性粒细胞的强效和选择性趋化剂，可从巨噬细胞和上皮细胞以及活化的嗜中性粒细胞中释放出来。在疾病恶化期间，LTB4的增加可能导致嗜中性粒细胞流入的增加[12]。8-iso-PG是活性氧损伤细胞膜脂质花生四烯酸发生脂质过氧化而形成的稳定的终末产物，是很强的血管收缩剂，且与去甲肾上腺素和血管紧张素具有协同作用；氧化损伤后细胞膜上酯化的8-iso-PG增加，可作为体内氧化应激的良好指标[13]。TNF-α是由多种不同的细胞(如刺激的单核细胞，成纤维细胞和内皮细胞)产生的多效性炎性细胞因子[5]。熊小明等[2]发现，LTB4、8-iso-PG等炎症因子参与了ACOS患者气道炎症过程，并具有潜在的鉴别ACOS生物标志物价值。刘洋等[14]研究证实ACOS患者在治疗后EBC中8-iso-PG、LTB4、TNF-α均显著降低，并且发现FEV1与8-iso-PG、LTB4、TNF-α呈负相关。与先前研究相似，本研究通过Pearson分析发现，EBC中细胞因子8-iso-PG、LTB4、TNF-α水平与ACOS患者的FEV1、FVC、FEV1/FVC肺功能指标显著相关，提示ACOS患者全身炎症反应较重，并且与肺功能损伤严重相关，存在更明显的气流阻塞[15]。因此，这些测量值可用于评估ACOS患者气道炎症的严重程度。

由于类固醇会影响许多系统中的细胞因子水平，因此我们评估了吸入皮质类固醇对ACOS稳定期组患者和ACOS急性加重期亚组中细胞因子水平的影响。观察到在吸入皮质类固醇后，ACOS稳定期组和ACOS急性加重期组患者的EBC中8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α均显著降低。实际上，吸入皮质类固醇在ACOS中的作用是一个不断争论的问题。从这项研究可以得出结论，吸入皮质类固醇对EBC中的细胞因子肯定有作用，甚至可以通过证明吸入皮质类固醇对8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α的影响来强调这种作用。Ojanguren等[16]观察到与本研究相似地结果，从稳定的ACOS患者的活检组织中采集的人支气管上皮细胞上清液中的8-iso-PG和LTB4浓度较低，并且二者与吸入皮质类固醇剂量呈负相关。此外，本研究还对同一患者的EBC与BALF液细胞因子水平的相关性进行分析。尽管每种细胞因子的数量各不相同，但仍然可以发现EBC与BALF液中8-iso-PG和LTB4细胞因子水平有显著相关性。虽然，研究无法对不同细胞因子的不同行为提供很好的解释，但是目前越来越多研究表明EBC在呼吸道医学中的有用性[5,17]。因此，EBC中8-iso-PG和LTB4细胞因子在估计ACOS中气道/肺部的炎症程度似乎表现更好，并且有助于医生监测疾病并合理地跟随治疗。

这项研究证实了8-iso-PG、LTB4在ACOS患者炎症监测中的重要作用。EBC中的8-iso-PG、LTB4在ACOS患者中明显增加，尤其是急性加重期患者，并且与患者的肺功能降低密切相关。因此，EBC中LTB4和8-iso-PG的测定为表征ACOS患者的炎症程度提供另一种有用的诊断工具，并可能有助于检测ACOS病情进展。