尺泽穴位注射对慢阻肺大鼠气道组织形态学和氧化水平的影响

黄培炜 林静瑜 周凡 周春权 许金森

慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是以持续存在呼吸道症状和气流受限为特征的慢性呼吸系统疾病[1]，致残率和病死率居高不下，预计不久，慢阻肺在全球死亡病因中位居第三[2]。氧化还原失衡是慢阻肺重要的发病机制之一，香烟烟雾，空气污染颗粒等氧化剂除了可直接造成气道组织的损伤，还可诱发气道组织的炎症反应、导致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，加重慢阻肺的发生发展[3]。目前临床上慢阻肺治疗仍无特效药，急性期以激素，扩张支气管、抗感染、机械通气等对症治疗，稳定期则以预防发作、延缓进展为主要治疗目标，然而远期综合疗效评估仍欠佳、且长期用药存在着副作用大的问题[4]。研究报道：针灸在改善慢阻肺患者临床体征、肺部功能，血气分析指标、提高生活质量等方面具有一定的效果[5-7]，且经济安全。本文建立脂多糖联合烟熏慢阻肺大鼠，考察肺经合穴尺泽穴注射生理盐水，对慢阻肺大鼠气道组织形态学及血清、肺组织SOD、MDA的影响，初步探讨针刺治疗慢阻肺的作用机理。

资料与方法

一、实验材料

1 动物

SD大鼠，雄性21只，清洁级，体重240±20g，9周龄，由上海斯莱克实验有限责任公司提供。许可证号码：SCXK(泸)2017-0005；合格证号码：20170005006824。

2 试剂与仪器

香烟(七匹狼，焦油量10mg，烟碱0.9mg，一氧化碳12mg)；脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(中国生物检验检定所，规格：100mg，批号：S09M10I87813)；自制气管插管；有机玻璃烟熏箱(大小为100cm×60cm×30cm)；SOD检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20191211)；MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20191010)：BCA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20191203)；酶标仪(Therom，Varioskan Flash)；低温高速离心机(Therom，ST16R)；DNP-9162型恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。

二、实验方法

1 大鼠慢阻肺模型制备

SD大鼠适应性喂养5d，随机分为正常组、模型组、尺泽组，每组7只。除正常外，其余两组均采用LPS气管内滴注+烟熏进行造模[8]，造模方法：大鼠分别于造模第1d、第35d，麻醉，固定于仰卧悬吊位，开口器张开口腔，拉出舌头，在探灯下，采用自制气管插管套针，气管内滴注1mg/mL的LPS溶液，0.2mg/200ul/鼠，滴注后休息6d，次日将大鼠置于体积0.18m3烟熏缸中进行烟熏(10支香烟，点燃放入熏烟箱内，关闭烟熏箱)，30mim/次/d，连续3w，第2次滴注后，休息6d，继续烟熏(15支香烟)3w。造模共8w，正常对照组大鼠于相同时间点暴露于空气中。

2 分组干预

于造模第6w开始，尺泽组进行干预治疗。大鼠以特制黑色弹性鼠套固定，轻抚至安静，拉出大鼠前肢，定位尺泽穴[9]，针尖沿前肢肺经方向，微斜刺(75℃)进针2-3mm，注射生理盐水0.1mL/鼠，1次/1d，左右穴位每日轮换，连续3w。模型组大鼠每日同等固定1min。

3 样本采集及观察指标

干预结束次日，大鼠麻醉，腹主动脉采血(尽量采尽血液)、离心，取血清；打开胸腔，暴露肺、气管，拍照；取气管及右肺第一叶固定位置肺组织1块，4%多聚甲醛固定，包埋、切片、光镜下观察病理形态学；另取1块肺组织，按1：9比例加入生理盐水，冰浴匀浆，稀释成不同比例，按南京建成试剂盒说明书检测血清、肺组织匀浆SOD活力、MDA水平。

4 数据处理与分析

结 果

1 各组大鼠气管、肺组织外观形态

(见图1)，从外观看：正常组大鼠气管外观清白透亮，触之韧性好；模型组大鼠气管外观苍白浑浊，见有较多粘液，触之质软烂；与模型组相比，尺泽组大鼠气管外观较透亮，颜色较鲜白，触之韧性较好；正常组大鼠肺颜色粉嫩，质地柔软，模型组大鼠肺颜色苍白，组织明显皱缩塌陷，质地较僵硬，部分呈现纤维化；尺泽组大鼠肺颜色鲜红，无明显皱缩，质地较模型组柔软，少部分见纤维化倾向。

图1 各组大鼠气管、肺典型外观形态学照片

2 各组大鼠气管、肺组织病理形态学

(见图2)正常组大鼠气管黏膜上皮完整，管腔内无脱落细胞，间质内无炎性细胞浸润；与正常组相比，模型组大鼠气管黏膜上皮细胞损伤，纤毛粘连、脱落，管壁充血水肿，腺体增生肥大。与模型组相比，尺泽组大鼠气管壁轻微增厚，少量杯状细胞增生，间质内少量炎性细胞浸润；正常组大鼠的肺组织肺泡大小均一，肺泡壁结构完整。模型组大鼠肺泡结构紊乱肺泡高度扩张，肺泡间隔变窄甚至断裂合成肺大疱，肺间质炎症细胞浸润。与模型相比，尺泽组肺泡局扩张融合程度明显改善，局部有轻度间质性炎症，间质增生，毛细血管增粗，少量炎症细胞浸润；与正常组相比，模型组支气管肺内出现以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，支气管壁杯状细胞数目增多，腺体增生肥大；与模型组相比，尺泽组支气管壁轻微增厚，少量杯状细胞增生。

图2 各组大鼠气管、肺组织病理图

3 各组大鼠血清、肺组织SOD、MDA

(见表1)与正常组比，模型组血清、肺组织SOD活力降低(血清SOD活力，P<0.05；肺组织SOD活力，P=0.1)；与模型组比，尺泽组血清、肺组织SOD活力升高(血清SOD活力，P<0.05；肺组织匀浆SOD活力，P=0.1)；与正常组比，模型组血清、肺组织MDA含量均有升高的趋势，但未有显著统计学差异；与模型组比，尺泽组肺组织MDA含量明显降低(肺组织MDA含量，P<0.05)。

表1 各组实验大鼠血清、肺匀浆液中的SOD活力和MDA含量

讨 论

慢阻肺在中医学上属“喘证"、“肺胀”、“痰饮”等范畴，急性期病机以“标实”为主，稳定期病机以“本虚”为主，病位主要在肺、脾、肾。目前中、西药物在治疗慢阻肺仍面临着许多困难，针灸是中医学率先走向世界的疗法，被称为“复兴的体表医学”，以其绿色健康的特色越来越受到国内外专家的关注。

经络学说是针灸发挥作用的理论基础，经络是以十二正经为主，运行气血，沟通人体表里内外的通道。《灵柩·海论》曰：“夫十二经脉者，内属于脏腑，外络于肢节”，表明经络和脏腑之间存在双向联系，“经脉-脏腑”功能相关[10]。手太阴肺经循行 “属肺，络大肠”，《灵枢·经脉》记载手太阴肺经的“是动则病”为“肺胀满、膨膨而喘咳”，明确提出肺经主治 “肺胀”、“喘”、“咳”这三种慢阻肺的典型症状。尺泽为手太阴肺经合穴，《难经·六十八》道：“合主逆气而泄”，《针灸甲乙经》中提到“主咳逆上气……咳嗽、唾浊、气膈、善呕”表明尺泽穴可治疗肺部相关疾病。研究发现：针灸肺经穴位对慢阻肺有一定的辅助作用[11,12]。

LPS诱导联合烟熏是经典的慢阻肺动物造模方法，该方法耗时较长，但是经气道、肺组织病理检测结果提示造模较成功，且该模型更能进一步模拟疾病的发生、发展的过程。本研究在造模中段进行单纯穴位注射生理盐水干预，主要侧重考察大鼠暴露于烟熏环境下，针刺对慢阻肺的防治作用。本文形态学方面的结果表明：经过尺泽穴注射生理盐水治疗后，慢阻肺大鼠气管、肺组织大体外观形态及病理形态学的病变均得到减轻，说明尺泽穴确实具有一定治疗慢阻肺的作用。

氧化-抗氧化失衡是慢阻肺重要的发病机制之一。正常机体内氧化物和抗氧化物处在平衡的状态。假如过多的外源性、内源性氧化物消耗大量的抗氧化物，那会导致机体内原本平衡的氧化物和抗氧化物被打破[13]。吸烟是诱发慢阻肺的首要环境风险因素，香烟烟雾中含有的羟自由基、一氧化氮、过氧化氢等和空气污染颗粒物都属于外源性氧化物。这些外源性氧化物除可对肺部和气道直接产生损害，还通过不同途径刺激气道、肺组织产生炎症反应，释放各种内源性氧化物，产生氧化应激反应，引起DNA损伤、蛋白质修饰改变、脂质过氧化等。长期的氧化负荷消耗大量内源性抗氧化剂，进一步导致机体氧化-抗氧化失衡，促进了慢阻肺的发病和急性加重等。许多研究发现：抗氧化的药物治疗，如N-乙酰半胱氨酸、氨溴索、维生素、多酚等，可在一定程度上影响慢阻肺的气道重塑[14,15]，延缓肺功能下降等[16-18]。研究显示：针刺(穴位注射)疗法具有抗氧化应激，减少氧自由基损伤[19]，对多种组织病变具有保护作用[20,21]。因此，本研究从氧化应激机制的角度，探讨针刺防治慢阻肺的机理。SOD属于代谢过程中的自由基消除剂，具有阻止细胞核氧化裂解的作用。MDA是脂质过氧化产物之一，其浓度间接反映了机体受到氧自由基损害程度。本文实验结果也显示：慢阻肺模型大鼠血清、肺组织SOD活力下降、MDA含量上升，存在明显的氧化-抗氧化失衡，尺泽穴位注射能够在一定程度纠正这种失衡状态，表现在干预后慢阻肺大鼠的血清、肺SOD活力升高，MDA含量降低。表明尺泽穴位注射治疗慢阻肺的作用机制可能与纠正氧化-抗氧化失衡有关。

慢阻肺的发病机制，除了公认的慢性炎症、氧化-抗氧化失衡及蛋白酶-抗蛋白酶失衡这三种学说[3]，还包括基因易感-环境相互作用[22]、肺部和肠道微生物群落失衡[23]、自身免疫疾病[24]、损伤与修复异常[25]等新学说。其典型的病理学特征为：终末细支气管和过度细支气管的数量减少、肺气肿、肺部血管的破坏[26]。我们后续将从观察肺功能、血氧饱和度等多方面，继续考察尺泽穴位注射防治慢阻肺的作用，并从抗炎、纠正蛋白酶-抗蛋白酶失衡、调节免疫功能等方面探讨其机理，为临床针灸治疗慢阻肺提供依据。