西宁市牛衣原体病流行病学调查

（西宁市动物疫病预防控制中心，西宁 630100）

牛衣原体病是由流产嗜性衣原体所引起的牛的一种地方性传染病，主要症状包括发热、怀孕母牛繁殖障碍、肺炎、肠炎、多发性关节炎和脑脊髓炎等，被感染母牛多发生流产、早产和产死胎。流产嗜性衣原体可感染牛和与之密切接触的人，是一种人畜共患病病原。国内的家畜衣原体阳性率比较高[1]。牛衣原体病在世界各地均有发生，在我国新疆、内蒙古等西北地区多发，给畜牧业及公共卫生造成不同程度的影响[2～4]。在青海省也有一些牛衣原体的相关调查，如祁小英等报道青海省乐都县牛衣原体抗体检测阳性率为2.16%（5/232）[5]。为了调查掌握牛衣原体病在西宁市的感染情况，本试验采用间接血凝（IHA）试验检测了牛衣原体的阳性率，并通过PCR试验对间接血凝试验阳性样本进行了确定，旨在为本地区牛衣原体防控工作提供基础数据。

1 材料

1.1 样品来源

样品来自青海省西宁市三县三区221个养殖场（户），其中散户172户，规模养殖户41户，规模养殖场8个。共采集血液样品、肛拭子和生殖道拭子各1 255份（其中肉牛各782份，奶牛各383份，牦牛各90份）。血液样品均由兽医通过无菌采集，按常规方法分离血清，置-20℃保存；肛拭子和生殖道拭子由兽医用无菌的棉签采集，置-20℃保存。并详细记录牛群基本情况，如来源、品种、日龄等。详见表1和表2。

表1 牛血清样品统计 单位：份

表2 肛拭子和生殖道拭子样品统计 单位：份

1.2 试剂

衣原体间接血凝抗原、稀释液、阴性血清、阳性血清（购自中国农业科学院兰州兽医研究所，产品号20180703204）；DNA提取试剂盒，衣原体PCR检测试剂盒（购自哈尔滨元亨生物药业有限公司，产品号CHL20190124P）。

2 方法

2.1 间接血凝试验

2.1.1 稀释血清

96孔板每孔加稀释液75μL，取待检血清25μL加入第1孔，以4倍稀释，从第1孔稀释至第3孔（即1∶4、1∶16、1∶64），第3孔弃去25μL，孔内液体量仍为75μL。同一时间，在同一板上设阳性对照2孔，阴性对照2孔，空白对照2孔。

2.1.2 加抗原

在每个孔中加入抗原25μL，放在微型振荡器上，振荡2min后盖上一次性封口膜，然后在37℃下作用2h判定结果。

2.1.3 结果判定

对照各孔均成立，则被检血清1∶16孔出现“++”以上者为阳性；1∶4 孔出现“+”以下者为阴性；1∶4孔“++”至 1∶16 孔“+”以下者为可疑。

2.2 PCR试验

2.2.1 拭子样品处理

采集的拭子保存管里加入1.5mL生理盐水振荡混匀，8 000r/min离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中，再加入200μL消化液和20μL蛋白酶K，振荡混匀后，置56℃水浴中消化1h。阳性对照100μL，加入200μL消化液和20μL蛋白酶K，振荡混匀后，56℃水浴消化1h。阴性对照100μL，加入200μL消化液和20μL蛋白酶K，振荡混匀后，置56℃水浴中消化1h。

2.2.2 病原体核酸提取

从水浴锅中取出样品管，待冷却至室温后，按操作说明，用DNA提取试剂盒提取衣原体DNA，最后离心管中液体即为模板DNA。

2.2.3 PCR扩增

每份总体积20μL，含16μLPCR反应液（用前混匀），2μLTaqDNA聚合酶，2μL模板DNA。PCR程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环；72℃延伸10min。

2.2.4 电泳

将PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳，110～120V，电泳液为50倍稀释的TAE电泳液，紫外灯下观察结果。

2.2.5 结果判定

阳性对照出现294bp扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，试验结果成立。被检样品出现294bp扩增带为衣原体阳性，否则为阴性。

3 检测结果

间接血凝（IHA）试验和PCR试验检测结果一致。间接血凝试验阳性检出率为1.51%（19/1255），其中牦牛血清阳性检出率为0（0/90）、奶牛血清阳性检出率为1.31%（5/383）、肉牛血清阳性检出率为1.79%（14/782）。肛拭子和生殖道拭子PCR阳性检出率均为1.51%（19/1255）。详细结果见表3～4以及图1～2。

图1 PCR检测结果1

表3 牦牛、肉牛、奶牛衣原体IHA试验检测结果统计表 单位：份、%

表4 拭子PCR检测结果统计 单位：份、%

图2 PCR检测结果2

4 分析与讨论

4.1 据统计，西宁市目前牛的养殖量为428 894万头，其中湟中县牛存栏186 765头，湟源县牛存栏72 356头，大通县牛存栏164 800头，西宁市市郊牛存栏4 973头。此次样品采集来源于青海省西宁市三县三区的221个养殖场（户），共采集牛血液样品、肛拭子和生殖道拭子各1 255份，样品的采集及覆盖面基本上包括了西宁市牛的主要养殖地区，基本客观地反映了西宁市牛衣原体感染的总体情况。

4.2 西宁地区没有进行衣原体的疫苗免疫，从表3可以看出肉牛、奶牛均存在牛衣原体感染，阳性率分别为1.79%和1.31%，牛总体阳性率为1.51%。本次试验血清用间接血凝试验进行检测，棉拭子用PCR方法检测。间接血凝试验和PCR方法检出的阳性结果均一致，说明西宁地区的衣原体阳性牛全部为野毒感染，不存在疫苗免疫抗体的假阳性结果，因此可做进一步检测净化。

4.3 青海省大部分地区已经成为畜禽衣原体病的自然疫源地，且牛阳性率较羊要高，疫病整体呈逐年上升的趋势[6]。动物感染衣原体后主要表现流产、肺炎、肠炎、关节炎、结膜炎、脑脊髓炎。衣原体病又是人畜共患的疫病，人感染动物衣原体后主要表现为结膜炎、发热、头痛、肌痛和以阵发性咳嗽为主的间质性肺炎、流产等症状[6]。多年来习惯将牛、羊、猪的流产归结为由布鲁氏菌感染而引起，并没有对衣原体病引起足够重视。此次调查发现，西宁地区牛衣原体病血清学阳性率较高，说明因衣原体病引起流产而造成的经济损失不可小觑[7]。

4.4 图1和图2为PCR混样检测结果，PCR方法特异性好、敏感性高、检测周期短、重复性好，其检测快、结果准确，能有效节约时间，为疫情的快速处置提供了有力的技术支撑。但PCR检测成本较高，所以本次试验先通过混样检测，若样品中有阳性样品再逐个检测。IHA灵敏性和特异性强、操作简单，可以快速得出结果，此方法适用于衣原体病的大面积筛查。

4.5 此次调查发现，西宁地区养殖的牛存在衣原体感染情况，应主要采取以下防控措施：

（1）加强对调运牛的检疫检测管理，经实验室检测为阴性的牛方准调运。选用有效的消毒药进行场地消毒，衣原体在0.1%甲醛和0.5%石炭酸中经24h可被灭活，在75%酒精中1min可被灭活，在含氯消毒剂中1～30min被灭活，5% NaOH溶液浸泡病料3d可以杀灭衣原体。

（2）建立和实施牛群的衣原体疫苗免疫计划。淘汰发病种公牛；对再次发生流产或产弱犊的母牛应淘汰；名贵牛可隔离治疗。每年除定期进行血清学监测外，应定期进行免疫接种。

（3）坚持自繁自养，建立密闭的饲养系统，杜绝其他动物携带病原体进入。从外面引种时，应进行血清学检测，对有血清阳性、可疑的牛群，严禁引进。对衣原体检测阳性的牛及时进行淘汰，逐步达到净化。

（4）建立严格的卫生消毒制度。严格把好工作区大门通道消毒、产房消毒、圈舍消毒、场区环境消毒。对流产胎儿、死胎、胎衣要集中无害化处理，同时用2%～5%来苏儿或2% NaOH溶液等有效消毒剂进行严格消毒，加强产房卫生工作，以防新生犊牛感染本病。要防止其他动物（如猫、野鼠、犬、野鸟、家禽、牛、羊等）携带的疫源性衣原体的侵入和感染牛群。加强养殖场的消毒灭源和动物的饲养管理工作，保持畜舍卫生和动物健康。

（5）进一步加大样品采集的范围和数量，加快西宁市牛衣原体病的检测净化工作。