某奶牛场犊牛腹泻的病原诊断及防控建议

刘伯承，王慧，高帅,2，杨俊，周望平，蔡文杰

（1.湖南省畜牧兽医研究所，长沙 410131，2.湖南德人牧业科技有限公司，长沙 410131）

犊牛腹泻是奶牛场常见的一种临床疾病，主要危害1月龄以内的犊牛，多表现为爆发性腹泻，病程短、死亡率高，往往在一个时期内发病率可达80%，给养牛业带来较大的经济损失[1]。引起犊牛腹泻的主要病原体有细菌、病毒和隐孢子虫，细菌性的有大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌，病毒性的有牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒，其中由致病性大肠杆菌引起犊牛腹泻的占90%[2]，隐孢子虫是牛场环境中的常见寄生虫，可单独或与其他病原混合感染[3]。另外，一些非感染性因素如环境变化、气候变化、饲养管理等也是引起犊牛腹泻的重要原因。由于犊牛腹泻病因复杂，给防控该病造成了很大的困难。2019年10月，湖南常德市某牛场26头犊牛发生腹泻，为了确诊发病原因，无菌采集病死牛的肠内容物、肠组织、粪样送实验室，采用RT-PCR技术，对牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、隐孢子虫、大肠杆菌毒力基因及黏附素进行了核酸检测，并采用纸片法（K-B）进行药敏试验，为临床治疗提供参考。

1 临床症状

该场共有460头荷斯坦牛，88头哺乳犊牛，腹泻26头，死亡22头，发病年龄在15～40日龄间，病程在10日内。1～3日，病牛出现轻度腹泻，排白色黏稠粪便，少数出现高温（40～41℃），轻度厌食；3～4日，腹泻加重粪便呈蛋花水样（图1），体温正常；5日后出现低温（35～37℃），脱水，昏厥，精神状态极差；7日左右治疗无效死亡。

2 病理变化

解剖发现心脏有白色炎症，肺部呈黄色，易碎，有黄色黏稠液体。脾脏、肝脏无明显病变，胃内有未消化奶块与草料，小肠有水肿和出血（图2）。

3 样品采集

无菌采集4头病死牛的肠内容物、肠组织、粪样，编号45号、57号、33号、59号，放入冷藏箱，送华中农业大学动物实验室检测。

图1 粪便

图2 小肠

4 试验方法

4.1 牛病毒性腹泻病毒核酸检测

利用病毒RNA提取试剂盒从血清中提取RNA，反转录为cDNA，然后以其为模板用牛病毒性腹泻病毒鉴定性引物通过PCR检测牛病毒性腹泻病毒，PCR产物的预期大小为201bp。

4.2 牛轮状病毒核酸检测

利用病毒RNA提取试剂盒从粪便中提取RNA，反转录为cDNA，然后以其为模板用轮状病毒鉴定性引物通过PCR检测牛轮状病毒，PCR产物的预期大小为294bp。

4.3 牛冠状病毒核酸检测

利用病毒RNA提取试剂盒从粪便中提取RNA，反转录为cDNA，然后以其为模板用冠状病毒鉴定性引物通过PCR检测牛冠状病毒，PCR产物的预期大小为488bp。

4.4 隐孢子虫核酸检测

利用粪便DNA提取试剂盒从粪便中提取DNA，然后用隐孢子虫鉴定性引物通过巢式PCR检测隐孢子虫核酸，PCR产物的预期大小为830bp。

4.5 大肠杆菌毒力基因检测

对采集的样品进行鉴别培养、鉴定大肠杆菌，核酸检测大肠杆菌毒力基因Stx1、Stx2、eae、astA、sta、stb、lt 及大肠杆菌黏附素K88、K99基因。

4.6 药敏试验

用药敏纸片扩散法（K-B）对分离鉴定的astA毒力基因大肠杆菌进行药敏试验，参考临床实验室标准协会（CLSI）标准进行判断。

5 结果

利用RT-PCR检测牛病毒性腹泻病毒核酸、牛轮状病毒核酸、牛冠状病毒核酸，均未检测到核酸阳性样本（图3～5）；利用巢式PCR检测隐孢子虫核酸，检出1个阳性样本，阳性率为25%（图6）；核酸检测大肠杆菌毒力基因，在57-2小肠、45-2肠组织、45-3肠组织3个样品中分别检测出astA毒力基因，未检测出其他黏附素及毒力基因；3个样品分离出的大肠杆菌对红霉素、庆大霉素等10种常用抗生素全部严重耐药，耐药率达100%（表1）。

图3 牛病毒性腹泻病毒核酸检测结果

图4 牛轮状病毒核酸检测结果

图5 牛冠状病毒核酸检测结果

图6 隐孢子虫核酸检测结果

表1 astA毒力基因大肠杆菌药敏试验结果

6 讨论与分析

6.1 菌毒力基因检测分析

随着养牛业规模化扩大和集约化生产程度的提高，犊牛腹泻在养牛场中发病率和死亡也呈上升趋势[4]，致病性大肠杆菌是引起犊牛腹泻的主要病原体，其致病性并不完全与血清型有关，而主要是取决于其所产生的特定的毒力因子，如菌毛、铁摄取系统、外膜蛋白以及毒素等[5]，因此，毒力基因的检测已成为确定致病性大肠杆菌的常用方法[6]。从实验室检测结果可以看出，该牛场犊牛腹泻发病主要由肠聚集性大肠杆菌（EAEC）和牛隐孢子虫混合感染导致。astA基因是编码肠聚集性耐热毒素，与大肠埃希菌sta肠毒素基因有类似的性质[7]。张金宝等人的研究发现，致腹泻大肠杆菌携带的毒力基因较多，经常以两种或两种以上的毒力基因同时出现[8～10]，本次致犊牛腹泻大肠杆菌样品中仅检出astA一种毒力基因，结果与前人研究差异较大。目前牛源致腹泻大肠杆菌中astA毒力基因的相关研究较少，从发病日程、临床解剖、死亡率（85%）和astA检出率（75%）来看，本次致犊牛腹泻大肠杆菌致病力较强，astA毒力基因介导的致病机理值得进一步研究。

6.2 耐药性分析

由于抗生素药物使用量的不断加大和耐药基因的扩散和传播，大肠杆菌的耐药性正变得日益严重[11]，多重性耐药和耐药率也不断增高。本药敏试验表明，3个样品astA毒力基因大肠杆菌对受试的10种肠杆菌抗生素全部耐药，敏感率为0，耐药率为100%，与元振杰[12]等人对致腹泻大肠杆菌耐药性研究结果相差较大，该研究对氨苄西林、复方新诺明、庆大霉素、氯霉素、环丙沙星敏感性分别为22.5%、30.4%、40.2%、41.2%、46.1%，这可能与本研究中的牛场长期使用抗生素有关，但本次药敏试验受试样品数量过少，不能完全说明问题。目前，耐药性已经成为养殖生产中的突出问题，因此，养殖场应降低和规范使用抗生素，在防治过程中尽量用中草药制剂及抗生素替代品。

6.3 隐孢子虫

隐孢子虫是引起犊牛腹泻的重要寄生虫，通过受污染的水源和食物等途径传播。刘毅[13]对湖南省8个县隐孢子虫感染牛进行了调查，结果发现3、4月龄犊牛的感染率分别为100%、60%；Muhid等[14]对马来西亚16个奶牛养殖场的隐孢子虫感染率研究显示，隐孢子虫对断奶前和断奶后犊牛的感染率分别为30.8%和23.3%，牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫和安氏隐孢子虫对断奶后犊牛的感染率分别为35%、30%和30%，说明幼龄牛比其他年龄阶段牛感染率更高。黄柳梅[15]研究表明，我国部分省份的隐孢子虫病的感染率在4.49%、24%、19.71%、19.09%、13.65%、21.5%。本次检测隐孢子虫阳性率为25%（1/4），大部分调查研究认为，牛场隐孢子虫的感染率高低与环境卫生有着重要的关系，因此，加强环境卫生管理，做好杀虫、消毒灭源等工作，对预防犊牛腹泻至关重要。

综上所述，预防犊牛腹泻建议从以下几个方面进行：①防止病畜粪便污染食物和饮水，控制传染源并注意环境卫生，做好新生犊牛隔离饲养，防止相邻犊牛粪便接触；根据牛隐孢子虫卵囊的排出规律，对带虫牛舍的消毒及清扫应选择在早晨，用10%福尔马林、5%氨水或65℃以上30min均可杀死卵囊；病畜应隔离饲养，根据病情及时补液（氯化钠、碳酸氢钠、VC），防止脱水与酸中毒，采用抗菌消炎类中药灌服，用磺胺类药物驱虫，防止隐孢子虫继发感染。②给母畜和新生幼畜提供良好的营养，保证幼畜出生2h内，最迟不超过6h，吃到自身体重5%的高质量初乳，建立最佳的非特异性免疫。③在分娩前6周或2周给妊娠母牛接种大肠杆菌疫苗。④做好牛场内带牛消毒，每天更换一次垫料。⑤适当通风，保持舍内温度，给犊牛喝烧开过的温水。