发酵牦牛乳菌种筛选及加工工艺优化

（云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201）

牦牛乳口感香浓，具有“高浓度、高比重、高含量”的特点，发酵牦牛乳是一种以牦牛奶为原料，经杀菌、接种发酵剂发酵制成的传统饮品[1]。发酵乳的质量优劣与牛奶种类、乳固形物含量、牛奶理化特性及发酵剂等因素密切相关。为得到品质更好的发酵乳，多种菌株发酵是发酵乳的讨论热点，许荣誉等[2]研究发现约氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌具有耐强酸的能力和良好的发酵特性；于素素等[3]发现含有发酵乳杆菌的发酵牦牛乳具有良好的性能及风味；Rodriguezl等[4]用约氏乳杆菌和嗜热链球菌发酵牛乳，比普通发酵乳具有更好的物质代谢率。发酵乳的口感与牛奶种类也有关系，黄友鹰等[5,6]研究发现，牦牛奶脂肪和干物质含量高导致其发酵制品存在质地硬、香味不足等缺点。为提高单一乳发酵制品的品质，国外常把山羊奶与荷斯坦牛奶或水牛奶混合后发酵[7～9]。

为开发优质的发酵牦牛乳制品，本研究从10株乳酸菌中筛选适合牦牛乳发酵的3株菌，并与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌制成发酵剂。根据牦牛乳高蛋白质和高脂肪的特点，加入荷斯坦牛奶混合发酵，弥补单一牦牛乳发酵制品中存在的膻味较重、质地较硬等问题，为生产高品质牦牛发酵乳提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

牦牛乳（香格里拉高山牧场）；菌株：保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌，植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌，副干酪乳杆菌，婴儿双歧乳杆菌，约氏乳杆菌，发酵乳杆菌，罗伊氏乳杆菌。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵乳菌株筛选

将10种乳酸菌株分别接种到10mL灭菌MRS培养基中，于37℃恒温培养活化。活化后的菌种接种到脱脂牛乳中驯化增殖，菌种接种量为6%、4%、2%，40℃下恒温培养至凝乳。通过测定发酵乳的酸度、乳酸菌数、凝乳时间确定适宜发酵菌种。

1.2.2 复合菌种配比

根据前期试验，将经1.2.1试验筛选出的3种菌株与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按体积比1:1:1:1:1进行驯化（该比例下菌株协调共生，发酵性能最佳）。将驯化后的菌种按5%的添加量接种到脱脂奶粉培养基（含2%pH值6.86的PBS，2%番茄汁、6%胡萝卜汁、8%马铃薯汁）中培养至凝乳，加入冷冻干燥保护剂（20mL/L甘油、8g/L葡萄糖、20g/L抗坏血酸），于-80℃冻结后于-50℃、1～3MPa冷冻干燥72h，制成直投式复合发酵剂，于-20℃冰箱内冷藏备用。

1.2.3 发酵乳加工工艺设计

原料乳→预热（50～60℃）→均质（8～10MPa）→杀菌（85℃巴氏杀菌，10～20min）→冷却→接种→灌装→发酵→冷藏后熟→成品。

1.2.4 牦牛奶与荷斯坦牛奶的比例确定

将牦牛奶、荷斯坦牛奶分别按3:1、2:1、1:1、1:2、1:3比例加工制作为发酵乳，测定其感官评分，pH值、酸度、黏度及持水率，以确定最佳配比。

1.2.5 发酵乳工艺单因素试验

以发酵乳感官评分为指标，分别研究糖添加量（8%、8.5%、9%、9.5%、10%）、菌种添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、发酵温度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃）、发酵时间（20h、25h、30h、35h、40h）四个因素对其的影响。

1.2.6 发酵工艺优化

在单因素试验的基础上，采用响应面Box—Behnken试验设计，选取糖添加量、菌种添加量、发酵温度、发酵时间进行4因素3水平响应面分析，在中心值重复3次，以发酵乳感官评分为指标优化工艺参数。

1.3 测定指标

1.3.1 感官评分

组织10人评价小组，从色泽、气味、滋味及组织状态四个方面对发酵乳进行打分，评分标准如表1所示。

表1 发酵牦牛乳感官评分表

1.3.2 发酵牦牛乳理化指标测定

pH值：使用PHSJ-3F型pH计直接测定；持水力：参照Hassan的方法进行测定；酸度：参照GB 5009.239-2016进行测定；蛋白质：参照GB5009.5-2016进行测定；脂肪：参照GB5009.6-2016进行测定。

表2 单一发酵菌种筛选试验结果

1.3.3 发酵牦牛乳风味成分双乙酰的测定

用三氯乙酸溶液将样品稀释后，取10支试管加入0.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL标准液（各2支），用蒸馏水补足至10mL后，加入5mL三氯乙酸溶液。一组加0.5mL邻苯二胺溶液，另一组做空白对照，暗处放置30min后在335nm波长下测定吸光值。双乙酰含量（mg/L）=吸光度×1.2（换算系数）[10,11]。

1.3.4 发酵牦牛乳微生物指标检测

乳酸菌计数：参考GB4789.35-2016；大肠菌群计数：参考GB4789.3-2016；霉菌、酵母计数：参考GB4789.15-2016。

2 结果与分析

2.1 发酵牦牛乳菌种筛选

发酵菌种筛选结果如表2所示。从表2可以看出，采用发酵乳杆菌、约氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌制备的发酵乳色泽为微黄色，口感微酸或较酸，符合消费者的饮用喜好；发酵气味浓郁有香气，无异味；组织状态均匀细腻、无沉淀；发酵时间分别为6h、7.3h和6h，发酵乳中的活菌数量为2.8×107cfu/mL、3.8×107cfu/mL和3.7×109cfu/mL，其中罗伊氏乳杆菌是10株菌中发酵得到活菌数最多的菌株。李正华[12]发现罗伊氏乳杆菌制备的发酵乳滋味纯正，香气浓郁，凝乳质地光滑，口感细腻，而且乳酸菌总数和罗伊氏乳杆菌总数均达到较高水平；许荣誉等[2]研究发现约氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌具有良好的发酵特性；于素素等[3]发现含有发酵乳杆菌的发酵牦牛乳具有良好的性能及风味。本试验结果符合上述发现，故选用发酵乳杆菌、约氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌作为发酵剂。

2.2 牦牛奶与荷斯坦牛奶比例的确定

添加不同比例荷坦牛乳的发酵牦牛乳理化指标和感官评分，见表3和图1。

表3 不同牛乳添加比例发酵牦牛乳的理化指标

图1 不同牛乳添加比例发酵乳的感官评分

从表3可以看出，随着荷斯坦牛奶所占比例的升高，发酵乳的pH值逐渐下降，酸度增大，持水率先升高后下降。酸乳酸度通常在70～80°T口感最佳，当牦牛奶与荷斯坦牛奶比例为3:1和2:1时，发酵乳酸度分别为77.24°T和80.51°T，风味较好。

由图1可知，当牦牛奶与荷斯坦牛奶比例为3:1时，发酵乳质地较硬、颜色较黄，符合黄友鹰等[5,6]的报道，因为牦牛奶脂肪和干物质含量过高，发酵牦牛乳会出现质地硬、香味不足等缺点。当牦牛奶与荷斯坦牛奶比例为1:1、1:2和1: 3时，发酵乳有乳清析出，凝乳状态较差，感官评分值低。这是因为乳清析出的多少、酸奶的质地和口感由发酵乳的持水力决定，持水力越强则乳清析出越少。根据刘梦云[13]的研究，发酵牦牛乳的持水力低于荷斯坦牛发酵乳，这可能是由于酪蛋白各组分含量和结构不同造成的。荷斯坦牛发酵乳凝胶的微观结构空隙较小，交联结构大且致密，三维结构中的空穴较少，发酵乳凝胶的持水力、黏度、硬度和内聚性高于单一的发酵牦牛乳。结合表3和图1的结果，牦牛奶与荷斯坦牛奶比例为2:1时发酵乳组织状态好，感官评分最高，故选用该比例作为最佳比例。

2.3 单因素试验结果分析

图2 不同因素对感官评分的影响

在发酵过程中，糖添加量、菌种添加量、发酵温度和发酵时间均对发酵乳感官评分影响较大。用牦牛奶与荷斯坦牛奶比例为2:1进行单因素试验，结果如图2所示：

由图2A可知，随糖添加量的增加，发酵乳的感官评分先升高后降低，添加过多糖影响整体甜酸比，导致感官评分下降，故选取最适糖添加量为9%。

由图2B可知，菌种添加量为4%时感官评分最高，组织状态均匀稳定，口感爽滑细腻，风味醇厚，酸度适中。故选取最适菌种接种量为4%。

由图2C可知，随发酵温度升高，发酵乳感官评分先升高后降低。发酵温度为30℃时感官评分最高，此时混合菌相互促进生长，凝乳状态较好。高于30℃，后混合菌产酸性增强，乳清析出，乳中的风味物质释放较少，感官评分低，因此选择30℃为最适发酵温度。

由图2D可知，发酵时间为30h时发酵乳感官评分最佳。随时间延长，乳酸菌继续发酵产酸，导致部分酪蛋白溶解，乳中蛋白凝胶体受到破坏，黏度降低，乳清析出，感官评分降低，故选择最适发酵时间为30h。

2.4 响应面优化发酵工艺

2.4.1 响应面分析方案与结果

表4 响应面分析方案与结果

根据单因素试验的结果，建立Box-Behnken Design中心组合设计试验模型，通过拟合二次方程计算最佳工艺组合，选取糖添加量、菌种添加量、发酵温度、发酵时间进行4因素3水平响应面分析，结果见表4。

2.4.2 模型建立及显著性检验

利用Design-Expert8.0.6软件对表4进行多元回归拟合，得到糖的添加量（X1）、菌种添加量（X2）、发酵温度（X3）、发酵时间（X4）的二次方程为Y=92.33+0.42X1-5.42X2+1.33X3-0.33X4+2.25X1X2-0.50X1X3+0.50X1X4-2.50X2X3+1.00X2X4-1.00X3X4-4.92X12-10.67X22-5.04X32-4.29X42。回归模型方差分析见表5。

表5 感官评分回归模型方差分析

由表5可知，感官评分回归模型显著性检验P=0.0001＜0.01，表明二次多元回归模型的显著性为极显著；感官评分回归模型失拟性检验P=0.3965＞0.05，表明发酵乳感官评分二次回归模型与实际试验拟合性充分，模型失拟不显著。感官评分回归模型表明，决定系数R2=95.61%，信噪比为15.780，CV值为2.48%，说明方程的拟合度和可信度都很高，可用于发酵乳感官评价。综上所述，回归模型拟合程度良好，试验误差小，可以准确分析和预测发酵乳的感官评分，表明实验可信度高。由回归系数显著性表明，各因素对发酵乳感官评分的影响顺序为：菌种添加量＞发酵温度＞糖添加量＞发酵时间。

2.4.3 响应面分析与工艺优化

图3 -A 糖添加量（X1）、菌种添加量（X2）对感官评分的影响

图3 -B 菌种添加量（X2）、发酵温度（X3）对感官评分的影响

通过观察图3中响应面的变化情况和等高线的变化可反映出发酵乳糖添加量（X1）、菌种添加量（X2）、发酵温度（X3）和发酵时间（X4）的交互作用对感官评分的影响，等高线呈椭圆形或马鞍形则表示两因素交互作用显著。因素一次项（X2、X3）、交互项（X1X2、X2X3）及二次项（X12、X22、X32、X42）对结果影响显著（P＜0.05）；一次项（X1、X4）、交互项（X1X3、X1X4、X2X4、X3X4）对结果影响不显著（P＞0.05）。

图3-A、3-B为由二次回归方程拟合得到的响应值Y的等高线及三维曲面图，是回归方程的形象描述。由图可知，X1与X2，X3与X4之间交互作用显著（P＜0.05），对感官评分影响较大。由图3-A可知，感官评分随糖和菌种添加量的增加而后趋于平缓，糖和菌种添加量分别为9%、4%，感官评分趋于平缓，与方差分析结果相符合。由图3-B可知，感官评分随菌种添加量和发酵温度的增加呈先上升后下降的趋势，菌种添加量为4%，发酵温度为30℃，感官评分趋于平缓，与方差分析结果一致。得到发酵乳最佳发酵工艺条件为：糖添加量9.23%、菌种添加量4%、发酵温度28.9℃、发酵时间30h，感官评分达92.33分。在上述条件下进行验证试验，与理论值接近，证明此次试验有效。

2.5 发酵牦牛乳的理化指标

表6 发酵牦牛乳的理化指标

由表6可知，发酵牦牛乳的pH值为4.13，酸度为80.51°T，符合国家标准规定；持水率为96.57%，乳清析出少，组织状态好；蛋白质、脂肪含量分别为5.05g/100g、6.575g/100g，符合国家标准中关于发酵牦牛乳蛋白质不低于3.8/100g、脂肪含量不低于5.0g/100g的规定；双乙酰含量为1.02μg/mL（酸乳中双乙酰含量为0.90μg/mL时就能赋予酸乳令人愉悦的奶油香气）[14]。

2.6 发酵牦牛乳的微生物指标

表7 发酵乳的微生物指标

由表7可知，发酵牦牛乳中乳酸菌为3.575×107CFU/mL，符合GB 4789.35-2016相关规定。微生物检验结果为大肠菌群＜1MPN/100mL、酵母菌≤100CFU/mL、霉菌≤30CFU/mL，符合相关国家标准规定。

3 结论

牦牛奶具有高蛋白质和高脂肪的特点，因此牦牛发酵乳是一款营养价值极高的饮品。研究发现发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌具有良好的产香产酸能力，适合发酵牦牛乳，与保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌按1:1:1:1:1比例复配制成发酵剂，可有效改善发酵牦牛乳表层状态不佳、组织粗糙、酸香味不足的问题；在发酵牦牛乳时混合加入荷斯坦牛奶，能弥补单一牦牛发酵乳中存在的气味不佳、质地较硬等问题。通过单因素试验和响应面优化，探寻出了发酵牦牛乳的最佳工艺条件，为生产一款风味独特、符合食品质量标准的牦牛乳品提供了依据。