基于GC-MS技术分析不同贮藏年份陈皮挥发性成分差异

刘丽娜，傅曼琴，徐玉娟，吴继军，余元善，温 靖

（1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业农村部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广东 广州 510610；2.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524000）

【研究意义】陈皮（Pericarpium Citri Reticulatae,PCR）为芸香科植物橘（Citrus reticulateBlanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮［1］，为广东道地药材，位列广东三宝之首。《中华人民共和国药典》（一部，2005版）收载的陈皮药材［2］分为陈皮和广陈皮，其自古即有“陈久者良”的说法，具有行气、调中、燥湿化痰等功效［3-4］。其中广陈皮（新会陈皮）因其质优而独具地道药材的特色［5］，具有很高的市场价值。陈皮中含有挥发性成分，其挥发油直接作用于肠道平滑肌，可降低正常家兔肠道收缩频率［6］，对气管平滑肌有抑制［7］、抗氧化作用［8］。【前人研究进展】以往对陈皮挥发性成分的研究大部分采用提取挥发油的方法［9］。陈彤等［10］采用GC-MS建立8个不同产地22种陈皮挥发油的指纹图谱，结果表明，22种陈皮挥发油的相似度在0.886～1之间，其中4个地区的样品获得了良好区分，而来自广东云浮、广西梧州和广东清远3个产地的样品聚成一类，最终确定共有峰中左旋-α-蒎烯、α-法尼烯、β-蒎烯和微量组分中的大根香叶烯为显著贡献的主成分组分。裴亚萍［11］用GC-MS法分析以水和食用乙醇作为溶剂制备的陈皮提取物的挥发性香气成分，并与水蒸汽蒸馏法萃取的陈皮天然挥发性香成分进行成分比对，结果表明：3种样品经GC-MS分别检测出17种（陈皮水提取物）、13种（皮乙醇提取物）和9种（陈皮天然香成分）挥发性香气成分，3种样品中含有的主要挥发性成分均为糠醛、d-苧烯和α-松油醇。杨元丰等［12］采用主成分分析（PCA）和聚类分析对《中华人民共和国药典》中4个品种来源的陈皮挥发油GC-MS数据分析比较，通过主成分分析和聚类分析可将广东新会茶枝柑样品与其他样品大致分为两类。夏伦祝等［13］采用超临界CO2流体萃取法提取10批陈皮样品的脂溶性成分，采用GC-MS联用技术分析陈皮脂溶性成分中的特征成分，结果表明，10批样品中含有右旋柠檬烯、α-罗勒烯、α-吡喃酮、α-荜澄茄烯、反式-石竹烯等27种共有成分，其保留时间和峰面积形成了特征性指纹图谱。周欣等［14］用GC-MS方法分析不同年份新会陈皮挥发油的成分和含量，结果表明，随着年份增长，新会陈皮挥发油成分含量在3年内随着时间增长而增加，甚至出现一些新的成分。【本研究切入点】以往研究多采用提取陈皮挥发油结合GC-MS分析研究陈皮挥发性成分，对不同产地、不同来源的陈皮挥发油主成分以及特征香气成分进行分析并建立指纹图谱，但并未对检测到的陈皮挥发性成分全面说明，也未分析不同贮藏年份陈皮中挥发性成分的差异。【拟解决的关键问题】本研究采用顶空固相微萃取（HSSPME）结合气相色谱质谱联用（GC-MS）的方法对贮藏时间分别为1年（2017年）、5年（2013年）、15年（2003年）的新会陈皮样品中挥发性成分进行分析，明确不同贮藏时间陈皮挥发性成分的差异，为陈皮的品质鉴定及调控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017年、2013年、2003年产陈皮均购于江门市新宝堂陈皮有限公司，陈皮来源于同一果园当年12月份所采茶枝柑的成熟果皮，经同一方法陈化制得。

仪器设备：ME204分析天平（瑞士METTLER公司）、RHP-100 高速多功能粉碎机（浙江永康市荣浩工贸有限公司）、HWS-26 电热恒温水浴锅（上海恒科学仪器有限公司）、YH系列电热器（江苏近湖镇教学仪器厂）、GC-MS 6980N/5975B气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）、手动SPME进样器、50/30μm DVB/CAR/PDMS纤维萃取头（美国Supelco公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 陈皮中挥发性成分测定采用张浩［15］方法，加以修改。先将陈皮剪碎，用打粉机轻微打成粉状，打粉5 s后立即停止，避免高温破坏陈皮香气物质。称量0.50 g陈皮粉末于固相微萃取样品瓶中，加入5 mL蒸馏水浸泡20 min。

1.2.2 HS-SPME法 萃取头活化：250℃条件下，将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头置于气相色谱-质谱联用仪进样口活化30 min左右，直至色谱检测无干扰峰出现。HS-SPME：在待测样品加入磁性搅拌子于65℃恒温水浴，调整转速为150 r/min，在电热恒温加热搅拌器中平衡10 min，再将活化好的萃取头插入样品瓶的顶空部分，65℃条件下吸附30 min，最后将吸附好分析组分的萃取头拔出并插入GC-MS进样器中解吸。

1.2.3 色谱条件 Agilent6890N气相-色谱仪，色谱柱型号：DB-5 MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气：He，流量1.0 mL/min，进样量1.0 μL，分流进样20∶1，进样口温度250℃；升温程序：起始柱温40℃，以10℃/min的速率升温到70℃，然后以3℃/min的速率升温到190℃，再以10℃/min的速率升温到220℃。

1.2.4 质谱条件 Agilent5975B MSD质谱，电离方式EI，电子能量70 eV，离子源温度230℃，接口温度280℃，全程扫描范围m/z 40-500 AMU/sec。

1.2.5 挥发性成分测定 经顶空固相微萃取后，拔出萃取头，立即置于气相色谱进样口中解吸5 min，进行GC-MS分析。

1.3 分析方法

1.3.1 定性分析 化合物经质谱数据库检索与资料库相匹配，选择较高匹配度的检索结果，结合每个峰的质谱数据和化合物的质谱裂解特征，并结合参考文献中报道的已知化合物确认检测物成分，对其进行定性分析。

1.3.2 定量分析 单个化合物的质量分数利用峰面积归一化法进行相对定量，求得各挥发性化学组分的相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 陈皮中挥发性成分

如图1所示，不同贮藏年份陈皮挥发性成分的总离子流图总体差异不显著，对其中检测到的所有成分进行定性检索，从贮藏年份为2017年、2013年和2003年陈皮中分别检测出34种、38种和39种挥发性成分，将这些化合物按面积归一化计算，分别约占总峰面积的 96.78%、99.86%和99.40%。表明随着贮藏时间延长，陈皮中挥发性化合物种类增加；3个不同贮藏年份陈皮挥发性成分都主要包括烯烃类、醇类、酚类、醛类和酯类化合物，其中D-柠檬烯相对含量最高，达50%～65%，随陈皮贮藏时间延长，其相对含量逐渐降低，3-蒈烯和γ-松油烯的含量次之，达12%～21%，随陈皮贮藏时间延长，3-蒈烯含量逐渐增加，而γ-松油烯的含量逐渐减少（表1）。

进一步对不同贮藏年份陈皮中各挥发性成分的相对含量进行比较分析，发现随着贮藏年限延长，陈皮挥发性组分的种类及相对含量发生显著性差异，有逐年递增或递减的，也有先增后减或先减后增，说明不同挥发性物质的相对含量变化规律不同。

由表1可知，α-侧柏烯、蒎烯、γ-松油烯、芳樟醇、香茅醛等15种挥发性化合物相对含量递减或消失，如γ-松油烯，2017年陈皮相对含量为20.10 %，2013年的相对含量为17.48 %，2003年陈皮中则未检测到；挥发性物质含量递增或产生新的挥发性物质的有β-蒎烯、萜品油烯、香芹酚、β-石竹烯、月桂烯、D-香芹酮、石竹素、棕榈酸甲酯等18种化合物，且只在2003年陈皮的挥发性组分中检测到月桂烯、百里酚等香气成分；而某些挥发性成分只存在于某个贮藏年份的陈皮中，本研究检测到苯类及酮类化合物只存在于2003年贮藏的陈皮中。

图1 不同贮藏年份陈皮挥发性成分总离子流Fig.1 Total ion flow of volatile components of PCR in different storage years

表1 不同贮藏年份陈皮中挥发性成分及其相对含量Table 1 Volatile components in PCR in different storage years and their percentages

2.2 陈皮中主要香气成分

陈皮香气成分主要是萜烯类、醛类、酯类、醇类和酚类等多种含氧化合物，特征香气成分有D-柠檬烯、β-蒎烯、月桂烯、3-蒈烯、γ-松油烯、柠檬烯、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯、甜橙醛、癸醛、紫苏醛、α-松油醇等，达几十种之多，每种物质对香气的贡献大小取决于香气阈值［16］。在3个不同贮藏年份的陈皮挥发性组分中共检测到61种化合物（图2），其中烯烃类物质28种、占80%以上，是主要挥发性成分；醇类物质7种，醛类和酯类物质各6种，烷烃类和酚类物质各4种，苯和萘类物质各2种，醚类和酮类物质各1种。

图2 不同贮藏年份陈皮主要香气成分比较Fig.2 Comparison of main aroma components of PCR in different storage years

2.2.1 烯烃类 萜烯类化合物是陈皮挥发性物质中的主要成分［17］。烯烃类化合物是陈皮挥发性成分中含量最高的一类，在不同贮藏年份陈皮中呈显著差异性（图2）。在贮藏年份为2017年、2013年、2003年陈皮中分别检测出18、21、18种烯烃类物质，含量分别为88.42%、94.61%、77.76%。所有烯烃类物质中均以D-柠檬烯含量最高，分别为60.74%、59.05%、54.4%，3-蒈烯含量次之，分别为1.06%、12.23%、17.01%。亚甲基-1-环己烯、萜品油烯、β-石竹烯、α-芹子烯、α－法呢烯等5种物质在3个不同年份陈皮中的含量均大于0.1%。

2.2.2 酯类 酯类物质是陈皮挥发性成分的主要组分，仅次于烯烃类物质。在贮藏年份为2017年、2013年、2003年陈皮中分别检测出3、3、5 种酯类物质，含量分别为5.93%、3.71%、7.21%。乙酸橙花酯、N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯是3个不同贮藏年份陈皮中的共有成分，N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯的相对含量分别为5.86%、3.63%、6.82%，显著高于其他酯类物质。乙酸香叶酯、月桂酸甲酯只在2003年的陈皮中检测到，且含量均低于1%。

2.2.3 醛类 醛类物质也是陈皮挥发性成分的主要组分。由图2可知，随着贮藏年限延长，醛类物质的相对含量越来越低，种类也越来越少。在贮藏年份为2017年、2013年、2003年陈皮中分别检测出6、4、3种醛类物质，含量分别为1.28%、0.84%、0.49%；其中甜橙醛的相对含量最高，随着贮藏年限延长，其含量先增加后减少；醛类物质对陈皮香气有重要贡献，特别是甜橙醛具有愉悦香气，是陈皮精油特征香气的主要成分［18］。

2.2.4 酚类、醇类和萘类 酚类物质虽然含量不高，但对陈皮香气也有一定贡献。在贮藏年份为2017年、2013年、2003年的陈皮中共检出4种酚类化合物，香芹酚（0.1%、0.11%、0.18%）和4-异丙基-3-甲酚（0.12%、0.04%、0.17%）是3个不同贮藏年份陈皮的共有物质，且随着陈皮贮藏年限延长，香芹酚的相对含量逐渐增加；在2003年陈皮种还检测到百里酚（0.07%）和壬基酚（0.14%）。共检出7种醇类化合物，含量分别为0.77%、0.13%、0.72，由此可知，随贮藏年限延长，陈皮中的醇类物质先减少后增加。芳樟醇只在2017年陈皮中检测到（0.24%），4-萜烯醇只在2013年陈皮中检测出（0.11%），两种物质的相对含量均大于0.1%。此外，在3个不同年份陈皮中均检测出（1S,8aR）-1-异丙基-4,7-二甲基-1,2,3,5,6,8a-六氢萘，含量分别为0.11%、0.2%、0.11%。在2003年陈皮中检测到D-香芹酮，含量为0.15%。而烷烃类物质只在2013年陈皮中检测到，相对含量为0.19%。

从3个不同贮藏年份陈皮挥发性成分分析来看，不同贮藏时间对陈皮香气的影响差异较大，可能与陈皮表面微生物的代谢活动有关［19］，随着贮藏时间延长，陈皮微生物的积累可能发生变化，从而影响陈皮挥发性成分组成，进而使陈皮的香气发生变化。

3 讨论

本研究以贮藏时间为1年（2017年）、5年（2013年）和15年（2003年）陈皮为对象，分析其挥发性成分差异，从3个不同贮藏年份的陈皮中共检测出61种化合物，其中贮藏1年、5年和15年陈皮中分别检测出34种、38种和39种挥发性成分，这一结果相较于提取挥发油［20］检测到的成分多，原因可能是因为顶空固相微萃取对于一些挥发性组分以及半挥发性组分灵敏度较好，能得到稳定可靠地定性定量结果；对于一些含量较低、低挥发性的组分来说，固相微萃取技术能有效起到一个富集的作用。

本研究结果表明，不同贮藏时间陈皮中D-柠檬烯相对含量最高，并随贮藏时间延长其相对含量会逐渐降低，邱芷柔等［21］为了最大化获取陈皮挥发性成分，采用顶空固相微萃取（HSSPME）结合气相色谱质谱联用仪（GC-MS）对不同贮藏年份陈皮进行分析，结果表明，3个不同贮藏年份陈皮中共检出44种挥发性成分，其中含量最高的是陈皮的特征香气代表D-柠檬烯；Yu等［22］对陈皮挥发油进行分析，主要成分为D-柠檬烯（5.28%）、1-甲基-4-（1-甲基乙基）-1,4-环己二烯（7.7%）、β-月桂烯（2.98%）、a，α-4-三甲基-3-环己烯-1-甲醇（0.94%）、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（0.87%）和α-蒎烯（0.53%）；Wang等［23］从青皮和陈皮分别检测出61、59种化合物，指出青皮和陈皮中D-柠檬烯的含量最高，分别占挥发油总量的65.61%，83.14%；以上研究结果与本文研究结果一致，进一步说明陈皮中的主要香气成分D-柠檬烯的含量最高。此外，Pernice等［24］研究还表明陈皮挥发油中的主要成分萜烯类化合物，具有较强的抗菌和抗氧化活，高蓓［25］研究也发现，广陈皮挥发油对黄曲霉和汉逊德巴利酵母均有一定抑菌效果，对黑曲霉无显著抑菌效果。

易伦朝等［26］采用GC-MS和HPLC-DAD联用技术，对不同年份自贡陈皮和“老化”模拟实验新会陈皮样品的挥发油和黄酮类成分进行分析，得到高含量的柠檬烯会使新鲜果皮产生不良气味，陈皮中柠檬烯的含量逐渐减少，气味随之香醇的结论，为陈皮“陈久者良”的说法找到了一定根据。本研究通过HS-SPME结合GC-MS对不同贮藏时间陈皮挥发性成分进行分析，明确陈皮中挥发性成分的变化规律，发现陈皮贮藏时间越久，萜烯类和醛类化合物含量越低，酯类、酚类和醇类物质含量越高；在陈皮贮藏15年间，D-柠檬烯相对含量逐渐减少，但均高于50%，这对研究陈皮陈化品质的形成及其调控具有参考价值。

4 结论

本研究结果表明，随着陈皮贮藏时间延长，陈皮挥发性物质的种类越来越丰富，烯烃类和萘类化合物相对含量先增加后减少，酯类、酚类和醇类物质含量先减少后增加，醛类化合物相对含量逐年递减。在陈皮陈化过程中，某些挥发性成分会消失，同时也会生成新的物质，但依然是萜烯类、醛类及酯类化合物等作为挥发性物质的主要成分，其中以D-柠檬烯含量占比最大，达50%～65%。