模式生物斑马鱼在药物毒性评价中的应用及研究现状

曾 彬，张存艳，陈 凯

1四川中医药高等专科学校，绵阳 621000；2成都中医药大学药学院西南特色中药资源重点实验室，成都 611137

斑马鱼(Danio rerio或Zebrafish)是一种热带硬骨鱼，最早产于印度、东南亚等热带地区，因其体表具有延伸至尾部的蓝色水平条纹，形似斑马而得名[1]，此外，又名花条鱼、蓝条鱼和斑马担尼鱼等。通过对比斑马鱼与人类基因库，发现斑马鱼与人类基因组具有高度的相似性，相似度高达87.0%[2,3]，这意味着以斑马鱼为模式生物而取得的实验结果大多数也适用于人类。因此，笔者结合国内外近5年文献报道，综述了模式生物斑马鱼在药物毒性筛选方面的最新研究进展，并且通过对文献数量的统计，分析了当下斑马鱼研究涉及到的方向，以期对斑马鱼作为模式生物进行药物毒性筛选或基础研究提供参考。

1 斑马鱼在药物毒性评价中的应用

相比于其他哺乳动物，斑马鱼具有繁殖能力强、繁殖量大、生命周期短、养殖费用低、身体透明等特点。斑马鱼一次可以产卵300～600枚，并且精子可以冷冻保存[4]，从而减少对活体培养的需求。一般受精后24 h开始血液循环，48～72 h开始孵化，3～4天要器官就已形成，3～4个月后达到性成熟[5]，在3个月内长成成年鱼[6]，仅利用卵黄囊中的营养可以存活7 天。斑马鱼幼鱼体长只有1～4 mm，在96孔板单孔内可以放置5～7条，是目前惟一适合于微孔板高通量、高内涵、全自动化分析的脊椎动物模型[7]。与酵母、蠕虫或苍蝇相比，斑马鱼身体透明，具有可识别的器官系统，如肝脏、心脏、肾脏、胰腺等[8]，常以有机整体参与实验，打破了细胞和离体模型筛选药理活性的局限，可以直观地从整体水平评价药物的药理作用和毒理学终点。随着显微操作技术和转基因技术的不断成熟，已经实现了在斑马鱼体内特定位置植入荧光蛋白，获得不同种类荧光标记的斑马鱼品系，如已获得肝脏荧光、心脏荧光、脾脏荧光、肾脏荧光等品系的斑马鱼[9]，这些荧光在体内特定位置的表达有利于观察组织器官的精细变化。基于诸多突出的生理优势，斑马鱼逐渐发展成为一种用来研究基因和发育的脊椎动物模型，被广泛应用于药物的毒性物质筛选研究。

斑马鱼大多数器官的功能与人类器官相同，并表现出良好的生理功能[10]，适用于高通量表型筛选。常用的评价指标见表1[11-16]。

表1 斑马鱼用于药物评价的指标特征Table 1 Index characteristics of zebrafish used for drug evaluation

1.1 心脏毒性评价中的应用

斑马鱼的心脏有两个腔，类似于人类胚胎妊娠3周时的心脏。虽然存在明显的形态学差异，但由于斑马鱼心脏和人类心脏在解剖学、细胞生物学和膜生物学水平上高度保守的特性[17-19]，使其成为研究心脏发育和相关疾病的一个强有力的模型。

西药由于成分单一，研究透彻，故应用比较全面，以斑马鱼作为实验动物能够准确、快速做出评价。Li等[20]采用转基因斑马鱼Tg(kdrl:m Cherry)和Tg(myl7:GFP)评价溴氰菊酯对心血管系统的影响及其可能机制。发现以吖啶橙染色处理后的斑马鱼幼体在头、体、心、尾部区域均产生不同程度的细胞凋亡且呈剂量依赖性，说明溴氰菊酯可诱导细胞凋亡；以红色荧光蛋白标记的血管内皮细胞在共聚焦图像和荧光强度全合成的条件下，更清晰地反映了心脏形态的变化，表现出溴氰菊酯对其心脏的损伤。

中药虽然具有成分复杂、作用环节多、毒性靶器官不明确等特点，但作为一种完整的动物模型，斑马鱼可以对药物的心脏毒性进行准确、快速的评价，进而实现对药物靶器官的初步确定和药物毒性的快速、高通量筛选。Cao[21]以模式生物斑马鱼胚胎为研究模型，考察京大戟醋制前后不同极性部位对心脏的毒性作用。对受精后12 h发育正常的斑马鱼胚胎分别给予京大戟生品和醋制品的不同部位提取物，观察受精后72 h药物对斑马鱼胚胎心脏发育和心脏功能的影响。发现京大戟醋制前后不同极性部位对斑马鱼胚胎均具有心脏毒性，并呈一定的剂量相关性；主要表现为心脏发育缓慢、心包水肿、心率降低、心脏细胞出现凋亡现象。表明京大戟毒性作用的靶器官为心脏，说明可以用斑马鱼来筛选药物毒性作用的靶器官。除此之外，有研究者以马兜铃酸、木香挥发油、雷公藤红素、氯化钡等诱导斑马鱼心脏毒性[22-24]，均取得了可靠的实验结果。

多种药物的毒性在斑马鱼和人类之间是相通的。Zhu等[25]建立了卵黄囊微注射技术诱导斑马鱼心血管毒性程序，认为斑马鱼对已知的心脏毒性药物的反应或与人类相同，或与人类相似，而且斑马鱼能较准确的预测药物的心血管毒性。例如，在检测小分子物质对斑马鱼心率潜在的毒性作用过程中，23种测试药物中有22种在斑马鱼胚胎中表现出心动过缓和房室传导阻滞效应，这与通过人体观察到的现象相一致[26]，进一步说明斑马鱼是一种有价值的脊椎动物模型。

1.2 肝脏毒性评价中的应用

肝脏是人和动物主要的代谢器官，肝脏代谢相关的疾病已成为严重危害全人类身体健康的主要因素，因此，药物的肝毒性研究在医药行业显得尤为重要[27]。由于斑马鱼与人类在肝细胞组成、功能、信号和对损伤的反应等方面具有极高的相似性，且所有的消化器官在幼鱼120 h就已完全成熟，使得它们成为研究药物肝毒性的首选动物模型。Dai等[28]将发育4 h的肝脏荧光系斑马鱼暴露于不同浓度的香加皮水提液中，通过测定幼鱼肝脏形态、肝脏荧光面积大小、肝脏荧光强度、肝细胞凋亡数、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性、天门冬氨酸转氨酶(aspartic transaminase，AST)活性等，最终得出香加皮水提液可能是通过破环斑马鱼体内氧化应激平衡而出现肝脏毒性，进而导致肝细胞凋亡。Luo等[29]以正常发育受精后3天的斑马鱼幼鱼为模型，用不同极性的醋甘遂提取物处理，统计给药后72 h内斑马鱼的死亡率，发现石油醚提取部位处理后的幼鱼给药组肝脏区颜色变暗，经苏木精-伊红染色后，发现有轻微的肝损伤；该研究首次以斑马鱼幼鱼为模型研究醋甘遂的肝脏毒性，为其临床安全、合理用药提供依据，并为斑马鱼模型用于药物毒性快速评价提供参考与指导。同样，为研究京大戟醋制前后不同极性部位对斑马鱼肝毒性的影响，Yao等[30]将受精后12 h的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的药液中至96 h，评价其肝毒性。发现京大戟醋制前后各极性部位对斑马鱼胚胎的肝毒性主要表现为肝脏发育缓慢、肝脏面积变小、肝脏颜色发黑、卵黄囊水肿、吸收延迟、出血，并且毒性随着浓度的增加而增强，在醋制后毒性反应降低。Quan等[31]首次用斑马鱼模型探索何首乌中18种成分的肝脏毒性作用，发现大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷对斑马鱼幼鱼肝脏具有一定毒性作用。

以上研究表明斑马鱼不仅可以作为中药提取物前期毒性筛选，同时也可用于有毒中药毒性靶器官以及对机体的损伤状况等研究。

1.3 肾脏毒性评价中的应用

肾脏疾病是一个全球性的问题，研究开发更好的治疗方法至关重要。动物模型可以更好地帮助人类认识各种肾脏疾病的病理学特点，并筛选治疗药物。作为斑马鱼主要的排泄器官，肾脏极易受到排泄物的损害，一旦受到损伤，斑马鱼就会因为渗透压调节障碍而出现不同程度的水肿[32]，如肾包膜水肿、心包水肿、眼球水肿等，甚则出现肾脏扭曲、肾小球等组织形态改变等。除此之外，也可以通过肾脏组织病理切片和转基因荧光斑马鱼观察肾组织的异常。

通过阅读整理斑马鱼肾脏毒性研究的相关文献报道，发现研究者已使用斑马鱼建立了各种肾毒性模型[33-35]，包括肾毒性引起的局部水肿(心包水肿、眼水肿和脑水肿等)或全身水肿模型、肾小球滤过障碍模型、肌酐检测模型以及基于基因构建的转基因斑马鱼模型等，这些模型为现代新药的研发提供了极大的帮助。Ding等[36]和Wang等[37]均采用斑马鱼模型评价了马兜铃酸(AA)的肾毒性，两者结果都说明斑马鱼模型可用于药物肾毒性的早期评价。Lindstrand等[38]将针对SOS Ras/Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子2(SOS2)和酸性磷酸酶1(ACPI)的吗啉代注射到斑马鱼胚胎中，观察到肾小管的形态发生了变化，如伸长，胚胎的整体体长也缩短了，胚胎在72 h时出现水肿[39]，虽然目前研究表明ACPI与肾功能之间没有明确的关联，但该实验为进一步研究ACPI的作用靶点提供了方向。还有研究报道醋甘遂[40]、款冬叶[41]在一定量时都会导致斑马鱼肾脏出现不同程度的损伤。以上结果提示，斑马鱼作为模式生物，在肾脏疾病研究中具有很大的发展潜能。

与此同时，斑马鱼肾脏模型也存在弊端，就是通常很难通过检测尿液的变化，来评估特定标记物的变化情况，因为可以检测的是培养斑马鱼的周围水，而不是纯尿液。此外，斑马鱼尿量小，而且尿液被释放到周围的水中，故临床常规使用的正常肾功能测试对斑马鱼肾病模型具有挑战性，这可能会限制斑马鱼作为肾脏疾病模型的应用。

1.4 脾脏毒性评价中的应用

脾脏是斑马鱼重要的免疫器官，在对抗外来抗原方面至关重要，主要起调控免疫作用。Ma等[42]发现全氟辛酸(PFOA)能使斑马鱼免疫系统损伤，脾脏出现细胞膜皱缩、脾脏空泡化等现象，并且存在明显的量-效关系，其机制与诱导白介素表达紊乱有关，该结果可用于评价水生生物的健康状况。Zhen等[43]用从香泽兰中提出的总黄酮，对斑马鱼进行水触媒染毒，21天后取出脾脏，制作石蜡切片，用苏木精-伊红染色，置显微镜下观察，发现随着总黄酮浓度的升高，斑马鱼脾脏出现脾窦扩张，脾脏内淋巴细胞数量增加，血细胞核浓缩等病变，表明适宜浓度的香泽兰总黄酮对斑马鱼脾脏有一定的毒性。就文献报道数量来看，对斑马鱼脾脏这一方面的研究还比较欠缺，有望成为日后研究斑马鱼的重点。

1.5 神经毒性评价中的应用

神经毒性是药物安全性评价的一个重要指标，然而相关实验的开展比较复杂，无论是行为学分析还是组织病理学检查，都面临很大的挑战。斑马鱼虽然是脊椎模式生物，但是斑马鱼的神经系统与人类和哺乳动物的中枢神经系统排列相似，可用于筛选神经系统药物的毒性。

有机磷阻燃剂是普遍存在的环境污染物，然而，关于其对环境影响的风险评估和毒性程度的认识却是有限的。为此，研究者探讨了急性和长期暴露于三磷酸盐(TDCPP)对斑马鱼神经系统的影响。通过检测TDCPP在斑马鱼脑组织中的分布情况，发现在雌雄斑马鱼的脑组织中都能观察到神经系统发育基因的下调，在雌性鱼中检测到更高的水平。表明在TDCPP诱导的神经毒性方面，雌性比雄性的应激性更敏感[44]。

1.6 五官毒性评价中的应用

五官为人和动物重要的构成部分，五官科疾病不仅会对机体造成严重的伤害，而且会影响生物体的日常行动、对生活造成不便。因此，构建斑马鱼五官科疾病模型十分必要。

Tang等[45]以不同浓度雷公藤多苷和二甲基亚砜饲养受精后5天的斑马鱼，将斑马鱼听细胞数量和听细胞荧光强度作为评价指标，发现雷公藤多苷剂量浓度为5.21 μg/mL时，对斑马鱼听细胞损伤率高达92.4%，且雷公藤苷对听细胞的损失趋势存在剂量依赖关系，随着浓度的增加，听细胞荧光强度也相应减弱，提示斑马鱼可用于耳毒性药物的活性筛选。三甲基氯化锡(TMT)是工业和农业领域中应用最广泛的有机锡化合物之一，广泛存在于土壤、水系、食品和家居用品中。据报道，TMT对神经系统表现毒性效应，然而，关于其对眼睛发育影响的信息有限，亦无明确的关联机制。因此，Kim等[46]提出了三甲基氯化锡(TMT)对斑马鱼眼部形态影响的研究，发现暴露在TMT下会缩短斑马鱼眼睛的轴向长度和表面积，损害斑马鱼识别光线的能力。该研究首次证明了TMT在眼部发育过程中具有毒性效应，并且这种毒性效应是在眼形成过程中，诱导视网膜细胞的凋亡而产生的。由于眼睛的结构和发育在脊椎动物中是相当保守的，因此，更好地了解TMT对斑马鱼眼部的发育毒性，为治疗人类因TMT暴露引起的疾病提供了潜在的策略。

2 斑马鱼研究所取得的学术成果

斑马鱼具有作为模式生物的的诸多优势，不仅在药物毒性研究中具有突出贡献，而且在生命科学领域发挥着越来越重要的作用，学术成果不断涌现，因此笔者收集了近5年国内外基于斑马鱼研究的SCI论文，分别从各国发表文章数量、研究的疾病类型、用于研究的斑马鱼年龄等方面多角度分析斑马鱼研究现状，发现近5年来，全世界基于斑马鱼模式系统的研究取得了快速发展，主要反映在以下几个方面。

2.1 发表SCI论文数量逐年递增

近五年，全世界斑马鱼研究的SCI源刊论文发表数量为17 966篇，呈逐年增加趋势(图1A)，其中我国发表论文数量为4 457篇，仅次于美国，超越德国、英国、加拿大等国家，成为第二大国(图1B)，占全世界SCI论文发表数量的四分之一(图1C)，表明各国越来越多的研究机构正在大力发展斑马鱼相关的科研工作，并且有望取得更多的研究成果。

图1 与斑马鱼相关的SCI论文年度统计图Fig.1 Statistical charts of SCI papers related to zebrafish注：A.近5年世界SCI论文数量；B.近5年各国发表SCI论文数量；C.中国发表SCI论文在世界的占比；D.涉及斑马鱼研究的疾病类型；E.用于研究的斑马鱼年龄(以Web of Science数据库为检索依据)。Note:A.Number of SCI papers in the world in the past 5 years;B.Number of SCI papers published by countries in the past 5 years;C.The proportion of SCI papers published by China in the world;D.Types of diseases involving zebrafish research;E.Age of zebrafish used for research(based on Web of Science Database).

2.2 研究内容日渐丰富

以斑马鱼为模式生物的研究内容更加丰富，领域更加广阔，并与现代生命科学研究的热点紧密契合。自2015年至2019年，世界范围内发表斑马鱼相关的SCI论文涉及的领域主要有药理学、毒理学、新药筛选等[47]。目前涉及的疾病类型主要有心血管类、肝脏类、肿瘤类等，其中对肿瘤和肝脏疾病的研究占比较大，表明斑马鱼在这两个方向的研究已成为当前热点(图1D)。

2.3 研究鱼龄因情况而异

斑马鱼各器官不同时期的成熟程度有差异，而不同药物对应不同的靶器官，这就意味着斑马鱼用于不同实验研究的年龄会有所差异，因此统计了药物在毒性筛选方面与年龄的数量关系(图1E)。研究表明，斑马鱼在48 h肝脏形态已初步形成，而在60～70 h肝脏迅速生长至合适大小[48]，因此实验中多以72 h的斑马鱼来筛选药物的肝脏毒性。心脏是斑马鱼第一个发挥功能的器官，从5 h左右开始迅速发育，48 h完全形成[49,50]，研究者多以24～71 h的斑马鱼心脏筛选药物毒性。由于成年鱼具有成熟的生殖系统，因此以成年鱼来筛选药物的生殖毒性。这类统计可以为研究者在实验时对斑马鱼的选择提供参考。

3 结语与展望

毒理学研究中哺乳动物试验成本高、耗时，通常在临床药物开发的后期进行，这些局限性阻碍了哺乳动物模型在某些疾病上的广泛应用。因此，寻求一个创新的、理想的实验动物模型来研究药物毒性、筛选药效已迫在眉睫。相比之下，斑马鱼在毒理学研究中相对成本低，可实现药物多批高通量筛选，因此，斑马鱼可用于药物临床前研究，以便在早期阶段筛选有毒化合物，并为进一步开发提供指导。

尽管斑马鱼作为优良的模式生物在药物毒性评价中受到广大研究者的推崇，但是也存在局限性。如斑马鱼与人的给药方式不同，大多以浸泡、替换液体等体外给药，幼鱼通过肠道、鳃和皮肤吸收周围水中稀释的小分子药物，但一些化合物具有疏水性，不能被斑马鱼胚胎和仔鱼充分吸收代谢，这种给药方式无法保证斑马鱼吸入药物量的恒定性，即无法准确地评价药效，可能出现假阳性结果[51,52]，降低实验结果的准确性。其次，很多药物都是在体内经过代谢活化而产生药效或者毒性，在用斑马鱼评价药物毒性过程中，很难确定是原药产生的毒性作用还是代谢产物产生的毒性，也很难判断在人体中是否会产生同样的代谢产物。虽然基因序列显示，斑马鱼与人类基因同源性较高，但结构和体型差异较大，且心血管系统只有1个心房、1个心室，与人类四腔心脏结构不同[53]。相比于人类与其他哺乳动物，在生命初期，斑马鱼的受精卵排出体外，胚胎离体发育，与人类受精卵、胚胎的发育过程存在一定的差异，并且斑马鱼属于水生动物模型，与人类生存环境大不相同，这也是建立各种斑马鱼疾病模型的不足之处，再次提醒我们任何形式的模型都有可能误导我们，需对这些生物体可实现的最终结果进行全面的理解与考量。

Zhu[54]通过卵黄囊微注射技术证实了微注射可以控制给斑马鱼的确切剂量，如果转换因子能够得到验证，则很容易将其转换为人类或哺乳动物的剂量。这种新型的给药方式，一定程度上克服了斑马鱼以往给药方式的弊端，为日后的研究提供了很大的帮助。

综上所述，斑马鱼作为21世纪新型模式生物，具有独特的实验优势，利用斑马鱼已经成功地实现了药物活性筛选，或已经阐明以前不完全了解的疾病机制。对于解决与人类相关的疾病问题，斑马鱼仍具有至关重要的作用，将其与哺乳动物实验、细胞分子实验紧密联系，定会为现代新药的研发做出巨大贡献，推动医药行业的迅速发展。