通过宏基因组二代测序技术辅助诊断非HIV相关耶氏肺孢子菌合并巨细胞病毒肺炎1例并文献复习

徐钰源，徐旭雯，梁广宇，李文飞，彭劼

(南方医科大学南方医院，广东 广州 510515)

耶氏肺孢子菌(PJ)和巨细胞病毒(CMV)都是引起免疫功能缺陷患者肺部机会性感染的常见病原体。PJ和CMV共感染是HIV相关免疫缺陷患者最常见的机会性感染之一，也容易引起临床医生的关注[1]。而在非HIV相关的免疫缺陷患者中，二者共感染所导致的临床症状往往不特异且进展迅速，病死率高，应当引起临床医生的重视。本文报道1例通过宏基因组新一代测序技术(mNGS)诊断的非HIV相关PJ合并CMV肺炎患者的诊疗经过，并复习文献以提高对该病的认识，为非HIV相关免疫缺陷重症肺炎患者的诊断、治疗及预后评估提供参考。

1 病例资料

1.1 入院情况 患者杨某，男性，23岁。因“咳嗽、咳痰1月余，发热、气促5 d”于2019年5月18日入院。患者2019年4月初开始出现咳嗽、咳痰，咳少量白痰，当地诊所予药物治疗(具体不详)后症状可缓解，但反复发作。2019年5月13日开始出现发热，体温最高38.0 ℃，自觉气促明显，伴胸闷，咳嗽、咳痰较前加重，咳白色粘痰，难咳出。2019年5月15日佛山市某医院查血常规示白细胞11.29×109/L，中性粒细胞百分比98.0%，血红蛋白100 g/L；C反应蛋白85.8 mg/L，降钙素原 0.27 ng/ml，血沉 71.00 mm/h，胸部CT示两肺多发异常密度影，右肺中叶节段性肺不张并感染，予多西环素联合哌拉西林舒巴坦抗感染、营养支持等治疗，患者仍反复发热，血氧饱和度下降，最低血氧饱和度约80%，予中流量给氧、雾化平喘治疗，并调整抗生素为头孢美唑联合莫西沙星后仍未见明显好转。2019年5月18日转入我院急诊，以“重症肺炎”收入感染内科ICU病房。患者既往于2007年在当地医院诊断为“多发性肌炎”，行气管切开并予大量糖皮质激素冲击治疗后好转，半年后停用激素。2016年10月再次出现四肢近端乏力，查肌酸激酶升高，开始长期口服“强的松65 mg每天1次，甲氨蝶呤 15 mg每周1次，羟氯喹0.2g每天2次”治疗，2017年3月左右强的松减量至40 mg每天1次。2017年4月再次因气促入住当地医院，查肌肉活检示：(右肱二头肌)横纹肌间穿插较多淋巴细胞浸润，灶性中性粒细胞聚集，可见小灶性肌纤维坏死，肌浆淡染，未见血管内皮增生，未见再生肌纤维，考虑炎性肌病，再次予气管切开、大剂量激素治疗后好转，出院后继续予“甲泼尼龙 40 mg每天1次，甲氨蝶呤 15 mg每周1次，羟氯喹0.2 g每天2次”治疗，后甲泼尼龙逐渐减量。此次发病前口服“甲泼尼龙 24 mg每天1次，吗替麦考酚酯 0.5 g每天2次，甲氨蝶呤 15 mg每周1次”治疗。2012年行右侧甲状腺次全切+右侧甲状旁腺瘤切除术。2019年3月患带状疱疹。入院查体：体温37.0 ℃，脉搏122次/分，呼吸32次/分，血压17.42/10.77 kPa；神志清楚，满月脸，面部可见痤疮，全身散在皮肤紫纹，右胸背部见陈旧性瘢痕及色素沉着分布。颈部可见一长约5 cm气管切开术后瘢痕，双肺呼吸音粗，右肺及左上肺呼吸音减弱，双肺可闻及干湿性啰音，无胸膜摩擦音。心率122次/分，律齐，无杂音。腹平软，无压痛、反跳痛，肝脾肋下未触及。四肢肌张力正常，双上肢肌力4级，双下肢肌力3级，病理反射未引出。

1.2 诊疗经过 入院后查血常规示白细胞6.14×109/L，淋巴细胞计数0.12×109/L，中性粒细胞计数5.88×109/L，血红蛋白89 g/L，血小板计数148×109/L；C反应蛋白162.09 mg/L；降钙素原0.194 ng/ml；淋巴细胞亚群NK 4.40%，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值0.67；心肌酶谱示CK 16 U/L，HBDH 360 U/L，LDH 428 U/L。糖化血红蛋白5.6%。血气分析示pH 7.414、PCO25.84 kPa、PO28.47 kPa、HCO3-27.1 mmol/L、BE 3.5 mmol/L、FiO251%。胸部CT：①双肺多发炎症伴实变；②心包少量积液，心腔密度减低，提示贫血可能；③双侧少量胸腔积液，邻近肺组织略受压膨胀不全；④甲状腺右侧叶未见显示；⑤胸椎骨质密度减低；⑥肝S7小钙化灶。入院诊断：①重症肺炎；②2型呼吸衰竭；③多发性肌炎。入院后即予呼吸湿化治疗仪辅助通气，由于患者长期使用糖皮质激素及细胞毒性药物，免疫力低下，外周血淋巴细胞计数仅0.12×109/L，CD4+T淋巴细胞计数<50个/微升(患者治疗过程中外周血白细胞、淋巴细胞计数变化分别见图1、图2)，予美罗培南、复方磺胺甲噁唑(TMP/SMX)，联合卡泊芬净针对细菌、真菌及耶氏肺孢子菌肺炎(PJP)抗感染治疗及雾化解痉、化痰、制酸护胃、补钙、补充人血白蛋白、纠正电解质紊乱、营养支持等治疗，并加用人免疫球蛋白20 g每天静滴1次。由于患者PO2<9.31 kPa，肺部病变严重，参考HIV感染合并PJP时皮质类固醇的治疗方案给予甲泼尼龙口服(首先每天32 mg 2次，共5 d；然后每天32 mg 1次，共5 d；再每天20 mg 1次，治疗11 d)，并参考神经内科及风湿免疫科会诊意见停用甲氨蝶呤，继续予吗替麦考酚酯0.5 g(每天2次)治疗多发性肌炎。患者呼吸窘迫症状加重，复查血气氧合指数仍<13.30 kPa，5月19日行床旁经口气管插管、改用有创呼吸机辅助通气，并行床边纤维支气管镜取肺泡灌洗液送检细菌真菌培养，G试验，GM试验，mNGS检测，5月21日肺泡灌洗液和血液标本mNGS结果回报均检测到PJ和CMV序列，遂停用美罗培南，加用更昔洛韦0.3 g 每12 h 1次抗病毒治疗，患者氧合指数逐渐好转，6月5日停用卡泊芬净。由于患者肌力减低，考虑患者短期内难以脱机，5月31日行经皮气管切开，6月5日支气管肺泡灌洗液(BALF)及痰培养均回报为多重耐药鲍曼不动杆菌，结合患者CT病灶吸收不佳，停用哌拉西林他唑巴坦，改用替加环素联合头孢哌酮舒巴坦抗感染治疗，监测患者氧合指数进一步改善，间断脱机训练并于6月10日脱机，6月11日停用更昔洛韦，6月14日复查CT提示肺部感染明显吸收，停用TMP/SMX(患者3次胸部CT变化见图3)。后患者堵管困难，请耳鼻喉科会诊，完善喉镜、颈部CT检查，声带未见明显息肉，考虑气道局部狭窄，予地塞米松雾化、逐步更换小号气管套管，于7月1日顺利封管，停用所有抗生素并予功能锻炼，7月12日病情好转出院。出院3个月后及半年随访，患者无发热气促等不适，生活完全自理。

2 讨论

2.1 概述 PJ可在健康人的肺泡中寄生，当宿主免疫功能受损时易发病，既往最多见于艾滋病患者，被认为是艾滋病患者的标志性疾病。而近年来随着抗逆转录病毒药物的广泛应用及PJP预防用药的实施，HIV相关的PJP发病率有所下降[1]，同时随着糖皮质激素、细胞毒性药物的广泛应用以及肿瘤放化疗、实体器官和造血干细胞移植的广泛开展，非HIV相关PJP发病率明显升高[2]。由于糖皮质激素可同时抑制细胞免疫和改变肺泡表面活性物质，使患者易于发生PJP，因此在非HIV感染者中使用糖皮质激素是发生PJP的最重要危险因素，同时接受糖皮质激素和细胞毒性药物治疗的患者发生PJP的风险尤其高，而这类患者往往也是发生CMV感染或再激活的高危人群。一项来自土耳其的研究发现，65.1%的非HIV相关PJP患者同时合并CMV感染[3]，而Qing Y等[4]研究结果显示非HIV相关PJP患者中有54%的患者同时合并肺部CMV感染，姜辉等[5]的回顾性研究发现非HIV相关PJP患者中，合并CMV血症者比例达44.1%，多因素Logistic 回归分析结果提示PJP合并CMV血症的独立危险因素分别为女性、合并真菌感染、进行有创机械通气。另一方面，多项关于实体器官移植受体的研究表明CMV感染是该类患者发生PJP的独立危险因素[6-7]，Meta分析的研究结果显示CMV感染可将器官移植术后患者发生PJP的风险增加3倍[8]，这可能与CMV感染可进一步抑制宿主辅助T细胞和抗原呈递细胞的功能，影响宿主对PJ的清除有关。

2.2 诊断 由于PJP和CMV肺炎在临床上都以发热、咳嗽、气促和呼吸困难为主要表现，肺部影像学都可以磨玻璃样改变和间质性肺炎为主，临床医生往往容易忽视二者的混合感染。因此，对免疫功能不全患者而言，病原学诊断尤为重要。长久以来PJP诊断的金标准是通过多种染色技术直接在肺组织或下呼吸道分泌物中发现PJ的包囊或滋养体，具有很高的特异性。常用的检测方法有吉姆萨染色、甲苯胺蓝染色、六胺银染色(GMS)和免疫荧光染色，其中GMS 最为常用。但GMS法受操作者染色技术及读片经验的影响较大，阳性率偏低。PCR 方法因敏感性高和操作简便等优势在PJ检测中具有广阔的应用前景，检测的标本可为BALF、呼吸道分泌物、外周血单个核细胞、血清等。刘文静等[9]比较了实时荧光PCR和GMS法对PJP的诊断价值，发现荧光PCR法的敏感性显著高于GMS法(13.97%vs 72.07%，P<0.01)，但PCR 法受引物设计、反应条件、人员操作等环节的影响，易造成假阳性。一些血清标志物包括1，3-β-D-葡聚糖(1，3-β-D-glucan，BG)、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原(Krebs Von den Lungen-6，KL-6)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase ，LDH)、S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)等也可辅助诊断PJP，其中，BG/KL-6联合检测是诊断准确率最高的血清学方法，其敏感性为94.3%，特异性为89.6%[10]。CMV肺炎诊断的金标准是肺组织中检测到典型的CMV 包涵体，当前正逐渐被无创检测方法所取代，常用的是血液和BALF中的CMV核酸定量扩增检测(quantitative nucleic acid amplification testing ，QNAT)。血中CMV DNA载量的动态监测不仅可以预测移植后发生CMV相关疾病的风险，还可以指导临床抢先抗病毒治疗的启动和终止，评估抗病毒疗效及预测发生CMV耐药的风险[11-12]。

近年来随着mNGS技术的不断成熟及普及，为重症肺炎患者的病原学诊断提供了一种新的有力手段。对于免疫功能受损患者而言，肺部多种病原体混合感染的发生概率明显增高，利用mNGS技术对此类患者的BALF进行病原微生物的检测可明显提高诊断的敏感性和时效。Wang J等[13]进行的一项回顾性的研究分析了mNGS在肺部混合感染病原学检测中的应用价值，发现mNGS对于肺部混合感染病原学诊断的敏感性要显著高于传统检测方法(97.2% vs 13.9%，P<0.01)，该研究中总共纳入55例患者，22例患者的肺组织或BALF中检测出CMV，13例患者检测出PJ，而其中7例(12.7%)为CMV和PJP共感染，是最常见的混合感染病原体组合。Li Y等[14]为了评估BALF的mNGS在严重呼吸道疾病病原诊断中的价值，对32例患者的35个BALF样本进行了mNGS检测，其中9例免疫缺陷患者的mNGS检测阳性率达到100%，与普通培养法比较，mNGS诊断的敏感性为88.89%，特异性为74.07%，两种方法的符合率为77.78%，mNGS的结果在11例 (34.4%)患者中导致了治疗策略的改变。而在该研究所检测到的真菌当中，PJ所占比例最高，占57%。本例患者在入院时我们根据其临床表现和影像学特点考虑PJP可能性大，使用TMP/SMX联合卡泊芬净抗感染治疗，因通过常规的PCR法检测血CMVDNA阴性，故一开始未加用更昔洛韦抗病毒治疗，患者病情仍进展，至5月21日mNGS结果回报外周血和BALF中均同时检测到PJ和CMV序列，我们据此调整了抗感染治疗方案，同时兼顾PJ和CMV的治疗后患者病情显著好转并最终治愈。

2.3 治疗 尽管没有关于非HIV相关PJP抗感染治疗的前瞻性的临床研究证据，目前TMP/SMX仍是治疗PJP患者的一线首选药物[15-17]，TMP的剂量为每天15～20 mg/kg，SMX的剂量为每天75～100 mg/kg，分4次口服。当患者存在使用TMP/SMX的禁忌或出现严重不良反应时可选择二线用药，包括克林霉素联合伯氨喹、喷他脒、阿托伐醌、氨苯砜等。其中克林霉素联合伯氨喹方案疗效与TMP/SMX 相似，但伯氨喹肝肾毒性较大，易发生血液系统损害，且在使用伯氨喹前需明确患者有无葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症。静脉单用喷他脒疗效逊于TMP/SMX，且会发生严重的肾功能损害、胰腺炎、心律失常、低血糖、高血糖、骨髓抑制等。阿托伐醌仅适用于轻-中度患者，氨苯砜效果不佳，仅适用于磺胺过敏者。由于非HIV相关PJP 患者往往病情进展迅速，迅速发展为呼吸衰竭，且常常伴有包括肾功能不全在内的多器官功能受损，导致该类患者无法使用足够剂量的TMP/SMX，因此近年来许多小样本的临床研究报告了卡泊芬净联合TMP/SMX治疗在该类患者中取得良好的疗效。国内一项Meta分析结果也显示卡泊芬净联合TMP/SMX可以提高PJP治疗的有效率(RR=1.25，95%CI1.11～1.42，P=0.0003)；与单用TMP/SMX治疗比较，联合治疗不会增加药物不良反应的发生率(RR=0.97，95%CI0.53～1.77，P=0.91)[18]。2016年欧洲非HIV感染血液病患者的PJP治疗指南和2019年美国移植协会指南中均推荐卡泊芬净联合TMP/SMX为二线治疗方案[16-17]。

由于该例患者免疫功能严重受损，CD4+T淋巴细胞计数<50个/微升，是PJ合并CMV共感染的高危人群，在此类免疫缺陷患者中如发生二者的混合感染，加用更昔洛韦抗病毒治疗是十分必要的。更昔洛韦治疗的起始剂量为每次5 mg/kg，每日2 次静脉滴注，持续治疗2～4周，或持续至血液中CMV-PCR 检测连续2 次均为阴性后，才考虑改为口服，其副作用为骨髓抑制和肾功能损害，故用药过程中需检测患者的血常规和肾功能。此外，缬更昔洛韦、膦甲酸钠、西多福韦也可以用于CMV肺炎的治疗。乐特莫韦是一种具有新型作用机制的抗巨细胞病毒药物，能抑制UL56编码的病毒末端转移酶，防止病毒DNA多联体的分裂和成熟病毒体的形成，对巨细胞病毒具有高度特异性，有口服和静脉两种剂型且与更昔洛韦无交叉耐药，在造血干细胞移植(HSCT)患者中的疗效及安全性均已得到证实[19]，而在其他器官移植受体的临床研究正在进行中。

关于是否使用糖皮质激素，虽然在非HIV相关PJP患者中的临床研究得出的结果并不一致，但是由于激素能阻止淋巴细胞和肺泡巨噬细胞介导的肺组织损伤，抑制中性粒细胞游走和多种炎性介质的释放，保护肺泡细胞，促进肺表面活性物质的释放，许多学者仍认为对于低氧血症(PaO2)在室内空气中<9.31 kPa的患者，应在抗感染治疗的同时使用糖皮质激素。为了获得最大的临床益处，应该尽早考虑使用糖皮质激素治疗，最好是在开始使用抗感染药物治疗的72 h内。糖皮质激素的最佳剂量尚未确定，我们参照HIV合并PJP患者的治疗剂量，给予甲泼尼龙21日疗法(首先每天32 mg 2次×5日，然后每天32mg 1次×5日，最后每天20 mg 1次×11日)后序贯到小剂量(每天8mg 1次)用于维持多发性肌炎的治疗，取得了较为满意的疗效。

2.4 预后 最后，关于合并CMV感染是否影响非HIV相关PJP患者的预后，临床研究的结果也并不一致。一项来自韩国的研究发现BALF中高CMV病毒载量(>2.52 log拷贝/毫升)的患者死亡率显著高于低CMV病毒载量的患者，但是具有低CMV特异性T细胞应答的患者的死亡率显着高于具有高CMV特异性T细胞应答的患者[20]。而Qing Y等[4]的研究发现尽管在非HIV相关PJP患者中是否合并肺部CMV感染对死亡率无明显影响，但BALF中更高的CMVDNA载量与死亡率呈正相关。姜辉等[5]的研究发现，非HIV-PJP 患者合并CMV 血症者28 d死亡风险明显增高。一项来自台湾的回顾性研究也发现死亡组与存活组患者相比，有更高比例的患者同时合并CMV感染，其原因除了CMV可抑制抗原呈递细胞和辅助性T淋巴细胞的功能导致PJ在肺组织中更不易清除，造成更为严重的肺组织损伤之外，也与CMV的再激活往往发生在免疫功能受损更为严重的患者中有关，而这类患者也往往容易发生更多的机会性感染，预后更差[21]。

综上所述，在长期服用糖皮质激素和其他免疫抑制剂的患者中，一旦淋巴细胞计数低于50个/微升，是发生PJP合并CMV肺炎的高危人群，这类患者病情进展迅速，病死率高。而使用mNGS进行病原学的检测可指导临床医生及早制定合理的抗感染抗病毒治疗方案，改善患者的预后。