整合分析KPNA2基因在肺腺癌中表达及临床意义

王荣，廖碧云，石凤，庞晓霞，刘中林，王俊利

(右江民族医学院医学检验学院，广西 百色 533000)

至今，肺癌仍然是一种发病率和死亡率极高的恶性肿瘤，严重危及人类的健康。非小细胞肺癌构成了肺癌患者中的主要类型，而非小细胞肺癌患者中大部分是肺腺癌，其成为研究的主要对象。肺腺癌的发生发展涉及诸多基因和复杂的信号通路，揭示该过程是当前基础研究的热点。由于大多患者诊断时已到晚期，肺腺癌的5年生存低于15%，寻找肺腺癌新标志物对肺腺癌防治有重要意义[1-2]。KPNA2蛋白作为一种核转运蛋白，含有N端、C端和重复的ARM序列，它结合核蛋白，进入细胞核发挥蛋白质转运作用[3]。近年，越来越多报道表明KPNA2在肿瘤中扮演重要角色，和肿瘤的进展、预后等密切相关[4]。本研究将运用生物信息学方法和软件分析Oncomine数据库等的数据，阐明KPNA2在肺腺癌中表达情况和临床意义。

1 资料与方法

1.1 从平台获取数据 Oncomine作为全球大型的癌基因芯片数据库及整合数据平台，为挖掘肿瘤数据信息提供了重要资料[5]。进入数据库，根据研究目的在数据库设置数据获取条件。UALCAN平台包含大量的癌症数据信息，是基于TCGA数据库进行癌症数据挖掘[6]。我们分析KPNA2在肺腺癌中表达，研究其和肿瘤分期及不同性别的联系，此外，采用Kaplan-Meier Plotter分析KPNA2表达水平与肺腺癌患者的预后关系。人蛋白质数据库(Human Protein Atlas，HPA)含有26000种人类蛋白质在组织和细胞分布，也有多种肿瘤组织中免疫组化情况[7]。因此，我们采用数据分析KPNA2基因在正常组织和肺腺癌组织中的免疫组化及在A549细胞中表达情况。cBioPortal获取大规模癌症的基因组学的分子谱和临床预后相关性，能够将这些丰富的数据集作为生物学解释和临床应用。TIMER数据库是目前使用较多研究基因和肿瘤免疫细胞浸润之间的关系的数据库，TIMER提供多种免疫细胞，比如B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞等的浸润情况。因此，我们使用上述数据库进行KPNA2多层次的生物信息学整合分析。

1.2 统计学方法 运用SPSS 23.0软件作t检验对比正常组织和肺腺癌组织之间KPNA2表达差异。Kaplan-Meier统计KPNA2表达与肺腺癌预后之间的关系。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KPNA2在不同类型肿瘤中表达 Oncomine分析总共获得445项KPNA2在肿瘤研究结果，包括79项有显著差异结果，表达增高74项，低表达5项。在10项肺腺癌研究结果中，KPNA2均呈现高表达。TIMER数据库分析也发现KPNA2在许多肿瘤包括肺腺癌中高表达，见图1。

2.2 KPNA2在肺腺癌中表达 我们再次在UALCAN平台分析，发现KPNA2在肺腺癌中的表达水平也显著高于正常组织(P<0.001)，见图2。免疫组化分析发现KPNA2蛋白在多个样本中呈阳性，见图3A。肺腺癌组织中的表达水平高于正常组织，见图3B、图3C。该蛋白主要定位于胞核和胞浆，见图3D。在A549细胞中免疫荧光实验显示，KPNA2在胞浆和胞核中，见图4。Oncomine数据库一共有9项研究关于KPNA2在肺腺癌和正常组织的mRNA表达。经数据库中的Meta分析作二次分析，和对照组相比，KPNA2在肺腺癌中表达升高(P<0.001)，见图5。

2.3 KPNA2基因表达与临床特征间关系 通过UALCAN平台分析KPNA2表达在TCGA数据库中患者的临床病理特征的关系。结果发现，KPNA2表达与肿瘤分期有密切关系。各个分期和正常组织间的表达均存在显著差异(P<0.001)，见图6A。不同性别的肺腺癌中KPNA2基因表达水平存在显著差异(P<0.001)，见图6B。

2.4 KPNA2与肺腺癌预后间的关系 在数据库之中进行分析，发现KPNA2在肺腺癌中表达增高。我们获取TCGA数据中相关的临床信息，继而确定该基因和肺腺癌患者预后之间的关系。在Kaplan-Meier Plotter分析后，我们发现KPNA2基因表达和肺腺癌预后存在高度相关性。KPNA2基因高表达水平的患者生存时间较短，低表达患者的预后较好(P<0.001)，见图7。

2.5 KPNA2共表达基因分析 为进一步阐释KPNA2的作用方式，我们采用cBioPotal数据库进行KPNA2基因的共表达基因分析。在相关系数>0.8和P<0.01的条件下，获得78个与其有显著相关性的基因，再采用DAVID进行功能富集分析，结果发现GO分析的BP模块包含有丝分裂姐妹染色单体分离、微管运动、染色体分离、有丝分裂胞质分裂和纺锤体组装。CC模块富集到细胞质、核浆、细胞核、胞膜和中心体。KEGG分析发现，它们和细胞周期、卵母细胞减数分裂、黄体酮介导的卵母细胞成熟、P53信号通路和FOXO信号通路。见表1。

表1 KPNA2共表达基因的GO分析和KEGG分析

2.6 KPNA2和免疫细胞浸润关系 我们利用TIMER数据库对KPNA2与免疫细胞浸润关系进行了相关性探索。KPNA2的表达与CD8+T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的浸润呈正相关(P<0.001)。KPNA2的表达与CD4+T细胞、B细胞的浸润呈负相关(P<0.001)，见图8。

3 讨论

核转运蛋白由输入蛋白家族和输出蛋白家族两大类组成，有着蛋白质转运的作用。其中，最具特征是输入蛋白家族，包括Karyopherin α和Karyopherin β两个家族。Karyopherin α家族含有7个成员，Karyopherin α1(KPNA2)是其中之一。KPNA2基因定位在染色体17q23-q24，KPNA2编码有529个氨基酸的蛋白质，分子量为58 kDa。该基因有3个结构单元组成，N端和importin β结合，核定位信号结合点和入核蛋白结合，C端的功能尚不明确。KPNA2基因参与细胞的复杂的信号通路，有着广泛的生物学功能。

目前，已经有针对KPNA2在部分肿瘤的报道。学者发现下调KPNA2基因可以减弱结肠癌细胞的增殖能力和克隆形成、迁移形成和裸鼠的成瘤能力，且结肠癌组织中mRNA水平和蛋白水平均高于正常组织[8]。在膀胱癌5637细胞株中，siRNA干扰技术下调的KPNA2可抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭[9]。此外，食管鳞癌中检测发现，KPNA2在癌组织的表达高于癌旁食管组织。而且高表达与肿瘤的分期、病理分级呈正相关，可作为判断肿瘤恶性程度和潜在转移能力的标志物[10]。在肿瘤代谢方面，有研究指出KPNA2通过双重作用于c-myc，从而参与调控胶质瘤细胞的糖酵解代谢重编程过程[11]。李倩等[12]通过分子生物学和细胞实验发现KPNA2通过Erk信号通路与其下游因子参与卵巢癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和顺铂敏感性等生物学行为的调控。李杰等[13]学者检测到KPAN2在胶质瘤中表达水平增高，与肿瘤分级呈正相关的关系，而与肿瘤预后呈负相关。敲出KPNA2基因，肿瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力减弱。谢明等[14]的研究表明KPNA2在结直肠癌组织中表达显著升高，对结直肠癌的预后判断有重要价值。分析KPNA2 基因在恶性黑素瘤和正常组织中表达，结果显示mRNA水平在正常皮损组织中低于恶性黑素瘤组织。生存分析揭示mRNA表达水平高的肿瘤患者预后比较差[15]。在舌鳞癌细胞CAL-27中转入siRNA，干扰后的KPNA2降低CAL-27细胞迁移侵袭能力[16]。转染KPNA2的过表达质粒，随后利用qPCR和Western blot检测到基因在骨肉瘤细胞143B细胞内表达水平显著上调。CCK-8实验、平板克隆形成实验展现出KPNA2上调促进了细胞增殖，过表达KPNA2加快细胞周期进程[17]。KPNA2在自噬过程中发挥作用依赖p53，通过调控p53的易位促进口腔鳞状细胞癌细胞的化疗耐药和转移[18]。这些研究几乎都指出KPNA2作为促癌基因参与肿瘤的增殖、迁移和侵袭等过程。

EGF和缺氧通过同时抑制IRF1表达和提高肺腺癌细胞的E2F1表达来促进KPNA2的表达[19]。这涉及该基因在细胞层次的机制研究。本研究从生物信息学方向探讨了KPNA2在肺腺癌中的表达及其和临床病理、预后的关系。通过Oncomine和TCGA数据库等中的资料分析，发现KPNA2在肺腺癌中表达升高，和肺腺癌的预后密切相关。KPNA2涉及P53和FOXO信号通路，还和部分免疫细胞浸润有关。结果表明KPNA2可以在肺腺癌中发挥促癌作用。本研究采用了权威的数据库进行分析，增加了结论的可信度。因此，这对后续开展基础实验有重要的意义，也为防治肺腺癌的确定新靶点提供了依据。