离子液体吸附剂对木犀草素的富集及CARS变量筛选的近红外光谱分析方法

贺小刚，阿迪拉·阿布都热西提，库尔班江·努尔麦提，努尔比耶·阿卜杜瓦柯，韩 想，冯昱龙，楚刚辉

(新疆特色药食用植物资源化学实验室，喀什大学 化学与环境科学学院，新疆 喀什 844000)

木犀草素(Luteolin)是一种常见的天然黄酮类化合物，存在于多种植物中，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性，富含木犀草素的药物常用于治疗疾病[1-3]。目前，木犀草素常见的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)[4-5]、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)[6]、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[7]、毛细管电泳-二极管阵列检测法(PCE-DAD)[8]等，这些方法虽具有很好的选择性，但存在分析速度慢、操作较繁琐、分析成本高、需使用有毒溶剂等缺陷。

近红外(NIR)光谱是介于可见光与中红外光的一种电磁辐射光谱[9-10]，由其发展的NIR分析技术由于速度快、无损、在线分析等突出优点，在医药、食品、化工、农业等方面具有广泛应用[11-14]。但近红外光谱分析的灵敏度较低，适用于含量大于0.1%的成分分析，对于微量成分，多利用吸附材料富集后再结合近红外光谱分析技术实现检测[15-16]。

离子液体(Ionic liquid,IL)是一种毒性很小的绿色溶剂，具有良好的导电性、溶解性、热稳定性和化学稳定性，在化学工业、生命科学、环境等领域中有着广泛应用[17-20]。Zeng等[21]研究发现，1-丁基-3-甲基咪唑溴化铵([Bmim]Br)水溶液可提高槐花中芦丁的提取含量；Han等[22]用1-丁基-3-甲基硫酸盐([Bmim][MS])水溶液结合超声辅助萃取法，提取了芹菜中的木犀草素和芹菜素，提取率比传统方法明显增加；Guan等[23]也用相同的方法富集了五味子中的木酚素。

竞争性自适应权重(CARS)法是一种比较新颖的变量筛选方法，是模仿达尔文进化理论“适者生存”原则所建立的一种变量选择方法，通过该方法可筛选出偏最小二乘回归(PLS)模型中回归系数绝对值大的波长点，筛除小的波长点，实现最优波长变量的组合[24-25]。通过去除冗杂的信息，达到提高分析精度的目的[26]。本文合成了一种咪唑型离子液体吸附剂，快速方便地富集稀溶液中的木犀草素，采用CARS变量筛选结合连续小波变换(CWT)光谱预处理的近红外光谱方法对木犀草素进行定量分析，为木犀草素提供了一种方便高效的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

AntarisⅡ近红外光谱仪、IR-200型红外光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；TU-1900型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；JJ-2增力电动搅拌器(金坛市医疗仪器厂)；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；SF-TDL-250A低速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)；ME204E电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；DF-4型压片机(天津市港东科技发展有限公司)；WS70-1红外快速干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)。

木犀草素(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑、氨水、D-葡萄糖、氯化钠(均为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；偶氮二异丁腈(AIBN，分析纯，上海试四赫维化工有限公司)；甲醇(色谱纯，天津光复科技发展有限公司)；正硅酸乙酯(分析纯，西安化学试剂厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 咪唑型离子液体吸附剂的合成参照Qiu等[27]的操作方法并适当改进：在三颈瓶中加入100 mL甲醇、2 mL(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷和15 mL正硅酸乙酯，于室温下搅拌30 min。然后加入2 mL纯水和2 mL氨水搅拌24 h，停止搅拌后将产物用离心机离心，用纯水洗涤至中性，再用甲醇洗涤2次，将所得样品放置于培养皿中，常温下晾干。即得巯基二氧化硅样品，研磨备用。

将上述合成的巯基二氧化硅加入三颈瓶中，再加入100 mL甲醇和1 mL 1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑，搅拌并水浴加热至60 ℃，加入0.04 g AIBN，恒温水浴搅拌48 h，离心，依次用纯水、甲醇洗涤后常温晾干，研细收集得到咪唑型离子液体吸附剂。其合成机理如图1所示。

图1 咪唑型离子液体吸附剂的合成机理Fig.1 Synthesis mechanism of imidazole ionic liquid adsorbent

1.2.2 木犀草素吸附实验称取0.15 g咪唑型离子液体吸附剂置于100 mL锥形瓶，加入一定浓度的木犀草素溶液，室温下振荡20 min。取样，用量筒式过滤器过滤，滤液在347 nm波长下测量吸光度，并计算吸附率(F%)。吸附率按下式计算：F%=100%×(A0-A)/A0，式中，A0和A分别为木犀草素溶液吸附前、后的吸光度。

1.2.3 木犀草素样品的制备与富集配制质量浓度为150 mg/L的木犀草素储备液，于0～4 ℃储存备用。在制备木犀草素测试溶液时，加入一定量的氯化钠、D-葡萄糖，以考察背景干扰对木犀草素测定的影响。将150 mg/L木犀草素储备液适当稀释，再加入1 mg/L氯化钠、10 mg/LD-葡萄糖，配制质量浓度为0.3～15 mg/L的70个木犀草素测试溶液。称取0.15 g吸附剂置于100 mL锥形瓶中，将70个木犀草素测试溶液加至锥形瓶中，常温振荡20 min后抽滤，收集滤渣，室温晾干后得到70个木犀草素样品，其中53个样品为校正模型，17个样品(4对重复样本)为预测模型，用于近红外光谱分析。

图2 70个木犀草素样品的近红外光谱Fig.2 Near-infrared spectra of the 70 luteolin samples

1.2.4 光谱测量方法将光谱仪在室温下预热1 h，选择近红外积分球漫反射测量70个样本的近红外光谱，扫描波数范围为4 000～10 000 cm-1，仪器分辨率为4 cm-1，测量时每隔1 h仪器自行进行背景校正。每个样品的近红外光谱经过64次扫描，重复3次，将3次测量结果取平均值作为样品的最终光谱数值。图2为70个样品的光谱图，因木犀草素的含量较少，70个样品的光谱图很难用肉眼区分。为提高近红外光谱的灵敏度，结合化学计量学方法，采用PLS方法构建模型。并根据仪器软件TQ analyst 9选择最佳波数范围为4 156.7～7 552.8 cm-1。

1.2.5 CARS 变量筛选CARS方法采用Matlab R2010b软件实现，是比较新颖的用于变量筛选的方法。该方法根据达尔文进化论中“适者生存”准则，将每个变量看成一个单独的个体，对变量进行逐步淘汰选择，去除不必要的信息，以提取光谱中与分析鉴定有关的有效变量信息，优化最优的变量子集，从而具有很高的计算效率，提高了模型的预测能力[28]。

2 结果与讨论

2.1 巯基二氧化硅、1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑、咪唑型离子液体吸附剂的红外光谱

分别对巯基二氧化硅、1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑和咪唑型离子液体吸附剂进行红外光谱测试，扫描光谱范围为400～4 000 cm-1，结果如图3a、b、c所示。相比于曲线a和b，曲线c中1 568 cm-1(很弱)处的吸收峰源于咪唑环骨架振动，1 460 cm-1处为甲基 C—H 的变形振动吸收峰，1 190 cm-1(很弱)处为咪唑环的伸缩振动。在曲线a中2 750 cm-1处为巯基的吸收峰，而反应后该峰消失，并在1 080 cm-1出现了C—S—C的振动吸收峰，曲线b中1 580 cm-1处为碳碳双键的振动吸收峰，强度很强，在反应后此峰消失。上述结果说明,1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑与巯基二氧化硅反应形成了咪唑型离子液体吸附剂。

图3 巯基二氧化硅(a)、1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑(b)和咪唑型离子液体吸附剂(c)的红外光谱Fig.3 Infrared spectra of sulfhydryl silica(a),1-allyl-3-methyl imidazole chloride(b) and imidazole ionic liquid adsorbent(c)

图4 木犀草素标准溶液吸附前(a)及吸附后(b)的紫外光谱Fig.4 UV spectra for luteolin before(a) and after(b) adsorption

2.2 吸附条件的优化

2.2.1 吸附剂用量的影响吸附剂用量是影响吸附效果的关键因素之一，为研究吸附剂用量与吸附率的关系，分别准确称取0.1、0.15、0.2、0.3 g的咪唑型离子液体吸附剂置于100 mL锥形瓶中，加入10 mg/L木犀草素水溶液，充分振荡20 min，抽滤，取上清液在347 nm波长下测其吸光度，并计算吸附率。结果表明，吸附率随着吸附剂用量的增加而增加，吸附剂用量为0.15 g时，得到的吸附率最大(为90.9%)，用量大于0.15 g后吸附率无明显变化。因此，选择最佳的吸附剂用量为0.15 g。

2.2.2 pH值的影响考察了不同pH值时木犀草素溶液的吸附效果，分别在6个100 mL锥形瓶中加入 0.15 g咪唑型离子液体吸附剂，再依次加入pH 值为 2、4、6、7、8、10的10 mg/L木犀草素水溶液。振荡20 min，抽滤，取上清液在347 nm波长下测定吸光度，并计算吸附率。结果显示，当pH<7时，吸附率随pH 值的增加而增加；pH 7时吸附率最大，达到90.1%；pH>7时，吸附率随pH 值的增加而急剧下降。因此，选择在pH 7条件下进行木犀草素的吸附。

2.2.3 振荡时间的影响在pH 7条件下，准确称取0.15 g咪唑型离子液体吸附剂，加入10 mg/L木犀草素溶液，常温下分别振荡2、5、10、20、40、60 min，同法测定吸光度并计算吸附率。结果表明，吸附率在20 min之前随着振荡时间的增加而逐渐增加，振荡时间为20 min时吸附率达到最大(为90.5%)，20 min之后几乎不变化。因此，选择最佳振荡时间为20 min。

2.3 咪唑型离子液体吸附剂对木犀草素的吸附效果

为探究咪唑型离子液体吸附剂对木犀草素的吸附效果，用10 mg/L木犀草素水溶液进行吸附实验。对吸附前后的木犀草素溶液进行紫外可见光谱检测(图4)，由图可知木犀草素的特征吸收波长为347 nm，与10 mg/L木犀草素标准溶液的吸收光谱(曲线a)相比，经吸附剂吸附后的吸收光谱(曲线b)在347 nm处几乎完全吸收，吸附率达90.9%。结果表明，该吸附剂对木犀草素具有良好的吸附作用。

2.4 吸附等温线

为研究该吸附剂的等温吸附行为，称取0.15 g咪唑型离子液体吸附剂，分别加入20、50、70、100、150、200、250、300 mg/L的木犀草素溶液，振荡20 min，离心5 min，取上清液在347 nm波长下测量吸光度并计算吸附量，绘制吸附等温线。通过下式计算吸附剂的吸附量：Qe=(C0-Ct)×V×10-3/m,式中：Qe为1 g吸附剂吸附的木犀草素质量，mg/g；C0为木犀草素的初始质量浓度，mg/L；Ct为吸附后木犀草素的质量浓度，mg/L；V为溶液总体积，mL；m为吸附剂质量，g。

Langmuir等温吸附模型可应用于研究吸附现象，该模型用公式(1)描述[29-30]：

(1)

式中：Ct为吸附后木犀草素的质量浓度，mg/L；Q0为理论的最大吸附量，mg/g；KL为Langmuir模型常数。

图5 木犀草素的吸附等温线Fig.5 The adsorption isotherm of luteolin

绘制木犀草素吸附量(Qe)与初始质量浓度(C0)的关系曲线，得到吸附等温线如图5所示。由图可知，随着初始质量浓度的增加，吸附量迅速增加，当木犀草素的质量浓度大于150 mg/L时，吸附量增加趋缓。以Ct/Qe对Ct绘图得到关系曲线(如图5插图)，线性方程为：y=0.128 3x+1.363 9(r2=0.997 2)。由此可知该吸附符合Langmuir等温吸附模型，根据线性方程得到木犀草素的最大吸附量为7.1 mg/g。

2.5 木犀草素的近红外光谱定量分析结果

2.5.1 定量校正模型的建立以PLS建立木犀草素的定量校正模型，将70个样品的光谱经过无处理、一阶导数(1st)、Savitzky-Golay平滑(SG)、连续小波变换(CWT)、多元散射校正(MSC)、标准正态变换(SNV)、MSC+CWT、SNV+1st等进行光谱预处理[31-33]，再通过蒙特卡洛交叉验证(MCCV)[34]法确定模型的因子数(Component number)，经过CARS波长变量优选获得最优波长变量集，获得更佳的定量模型为偏最小二乘回归-竞争性自适应权重(PLS-CARS)法，并与未经CARS变量筛选的模型进行对照。PLS和PLS-CARS均由Matlab R2010b软件实现。

由于近红外光谱中既包含木犀草素的光谱信息，也包含其他杂质的信息，通过采用合适的光谱预处理方法提取特征信息后进行分析。表1显示各种光谱预处理得到的木犀草素定量模型的预测能力，以交叉验证均方根误差(RMSECV)、相关系数R值和预测残差值(RPD)作为评价模型的指标，RMSECV反映了预测浓度与实际浓度的偏离程度，R值反映了预测浓度与真实浓度的相关关系，RPD反映了定量结果的好坏，一般RPD>2.5且值越大说明定量结果越好[35]。

由表1可知，相比于未经处理的PLS方法，样品经1st、CWT、SNV+CWT、MSC、MSC+1st、MSC+CWT、SG、SNV和SNV+1st处理后，RPD值增加，说明光谱预处理可有效改善定量结果，但RPD值增幅偏小，定量效果不好。且RPD值均小于2.5，表明不能准确定量分析木犀草素。

表1 未经CARS处理的木犀草素PLS模型的结果Table 1 Results of luteolin PLS model without CARS treatment

先采用CARS算法进行波长变量的优选，对样品进行1st、CWT、SNV、SNV+CWT、MSC、MSC+CWT、SG等光谱预处理后，再进行PLS分析，结果如表2所示。对比未采用CARS处理的模型，木犀草素样品的变量数均为1 557个，主因子数最大为9(表1)；而采用CARS进行变量优选后，所有近红外光谱预处理分析木犀草素样品的变量数均在60个以下，而且部分主因子数适当减小，除MSC+1st和SG两种光谱预处理后的RPD下降外，其余光谱预处理方法的RPD值均有不同程度的提高。其中，MSC的RPD由2.02增至3.26，SNV由2.02增至3.24，CWT由2.18增至3.63，这3个预处理方法在CARS变量优选后RPD增加明显，其中CWT的RMSECV最小，R和RPD值最大，能够达到定量分析的要求。结果表明，经过CARS优选有效的定量光谱信息后，CWT预处理光谱的定量效果最好。

表2 经过CARS处理的木犀草素PLS 模型的结果Table 2 Results of luteolin PLS model with CARS treatment

2.5.2 定量模型的验证为验证木犀草素定量校正模型的预测能力，使用17个外部预测集样品(4对重复样品)检验所建的校正模型，预测集的实验条件与校正集相同，并采用CWT光谱预处理进行验证,建立了预测浓度与参考浓度之间的关系(图6)。结果显示，未经CARS变量筛选前(图6A),预测浓度和参考浓度之间拟合关系的相关系数(R)为0.939 8，预测均方根误差(RMSEP)为1.173 3 mg/L，预测集样本回收率为83.2%～127%。经CARS变量筛选并用CWT光谱预处理后(图6B)，两者之间的拟合程度更好,R为0.950 3，RMSEP为1.100 8 mg/L，预测集样本回收率为77.8%～116%。结果表明，经CARS变量筛选处理并用CWT光谱预处理的模型定量效果更好，能够更准确地进行木犀草素含量的测定。

3 结 论

本文制备了一种咪唑型离子液体吸附剂，考察了吸附剂用量、pH值、振荡时间对稀溶液中木犀草素吸附效果的影响，结果表明在吸附剂用量为0.15 g、pH值为7、振荡时间为20 min时，吸附率达到最大(为90.9%)；另外通过吸附等温线得到该吸附剂对木犀草素的最大吸附量为7.1 mg/g。采用近红外光谱CARS变量筛选的方法对木犀草素进行了定量校正模型研究。结果显示，相比于未经CARS变量筛选的模型，经CARS变量筛选后所有近红外光谱预处理的样本变量数大大减少，由1 557个降为60个以下，部分主因子数适当减小，除MSC+1st和SG两种光谱预处理后的RPD结果下降外，其他光谱预处理的RPD结果均有提高。其中采用CWT光谱处理方法进行模型验证时，RPD由2.18提高到3.63且为最大值，R最大，且RMSEP最小。通过定量模型的对比，说明采用CARS变量筛选结合CWT光谱预处理方法的预测结果更加准确，可实现对稀溶液中木犀草素的快速检测。