活血补肾壮骨方对GIOP型大鼠骨折愈合的作用及对骨密度、血清碱性磷酸酶和骨钙素水平的影响*

段 硕 邓丹华 陈 磊 魏迎亮

（1.辽宁省沈阳市骨科医院，辽宁 沈阳 110044；2.辽宁省丹东市联勤保障部队第九六六医院，辽宁 丹东 118000；3.辽宁省沈阳二〇四医院，辽宁 沈阳 110043；4.中国医科大学附属盛京医院，辽宁 沈阳110004）

糖皮质激素性骨质疏松（GIOP）是指长期应用糖皮质激素（GC）治疗疾病而引起的继发性骨质疏松，以骨量减少、骨微结构破坏、骨强度下降为主要特征的一种代谢性疾病，发病率较高，仅次于绝经后和老年性骨质疏松［1］。GIOP易并生骨折，且愈合困难，致残率较高。目前临床对GIOP的治疗无特效方法，而GC又因其强大的药理作用被广泛应用于临床上，很多患者必须长期甚至终生使用，因此，寻求有效防治GIOP的方法是临床亟待解决的问题。活血补肾壮骨方是沈阳市骨科医院协定处方，有补肾壮骨、活血化瘀之功效。本研究通过肌内注射地塞米松诱导建立GIOP大鼠模型，

采用活血补肾壮骨方干预，旨在探讨活血补肾壮骨方对GIOP模型大鼠骨折愈合的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只清洁级雄性SD大鼠，7～8周龄，平均体质量（250±20）g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK（辽）2018-0002。室温20～25℃、相对湿度40%～50%下饲养，通风环境良好，自由饮水进食。

1.2 试药与仪器 活血补肾壮骨方组成：杜仲15 g，骨碎补15 g，淫羊藿15 g，淮山药15 g，菟丝子15 g，紫丹参10 g，当归10 g，红花10 g，茯苓10 g，龙骨 15 g，独活10 g，续断10 g，熟地黄20 g，川芎10 g，牛膝 10 g，甘草10 g；饮片均由本医院药房提供并煎煮，药材加水煎煮2次，生药质量浓度1 mg/mL。地塞米松磷酸钠注射液（广州白云山天心制药股份有限公司，批号1902067，规格：1 mL∶5 mg）；阿仑膦酸钠（扬子江药业集团上海海尼药业有限公司，批号1903182，规格：10 mg/片）；水合氯醛（分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶（TrACP）、Ⅰ型胶原交联羧基端肽（CTX-1）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。PDiscovery QDR型双能X线骨密度仪（美国Hologic公司）；ElectroForce 3200生物材料实验仪（美国Instron公司）；J-D200生物显微镜（深圳拓天仪器设备有限公司）；TE2000型荧光显微镜（日本Nikon公司）；计算机X射线摄像仪（日本柯尼卡美能达公司）；OLYMPUS BX-51型骨组织形态计量仪（美国BIOQUANT公司）。

1.3 分组与造模 随机法将实验大鼠分为空白组10只、造模组50只，造模组又分模型组、西药组，中药组（活血补肾壮骨方）低剂量、中剂量、高剂量各10只。建模前1周适应性饲养，除空白组外，其余大鼠均大腿部肌内注射地塞米松磷酸钠注射液，剂量1 mg/kg，每日1次，每周3次，每周称1次体质量，根据体质量调整剂量，连续注射9周。骨密度下降提示造模成功。9周后，按照闭合骨折模型方法，采用骨髓内针固定法行大鼠左侧股骨骨折。3.5%水合氯醛（10 μL/g）腹腔麻醉，自左股骨髁间凹处，垂直穿入直径1.0 mm克氏针达髓腔，拔出克氏针，在股骨中段以拇指为支点，用较缓和的力量徒手折骨，当感到骨折时，停止用力，避免骨折移位，克氏针从原穿针点进针，穿针到骨折远端，针尾埋于皮下，多余部分剪除，局部消毒后归笼。术后3 d常规抗感染处理，肌内注射青霉素100万U/kg。X线显示左股骨骨折，对位良好，髓内针固定在位，造模成功。建模未成功：空白组、模型组和中药中、高剂量组各1只，西药组、中药低剂量组各2只。

1.4 干预方法 术后第2天空白组和模型组给予生理盐水灌胃，剂量5 mg/kg；西药组给予阿仑膦酸钠5 mg/kg灌胃；中药组给予活血补肾壮骨方灌胃，低剂量组2.5 mg/kg、中剂量组5 mg/kg、高剂量组7.5 mg/kg；每天灌胃1次，连续10周。

1.5 标本采集与检测 骨转化指标测定：心脏取血，离心，取上层血清，采用试剂盒检测TrACP、CTX-1、ALP、OC水平，严格按说明书操作。骨密度测定：大鼠处死后无菌条件下剥离左侧股骨，剔除软组织，4℃避光保存在70%乙醇中，以双能X线骨密度仪测量股骨的骨密度（BMD）、组织骨密度（TMD），扫描2 cm阶段。骨组织形态计量学检测：截取剥离的左侧股骨远端干骺端组织，应用骨组织形态计量仪测定骨组织形态参数，包括骨小梁面积百分数（TbAr%）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）。骨生物力学测量：剥离的左侧股骨用生理盐水纱布包裹置于-20℃冰箱内保存备用。股骨解冻后行三点弯曲试验，支点跨距为20 mm，中央垂直（股骨与载荷成90°角）施加载荷，速率2 mm/min，测量并计算最大载荷、最大挠度和最大应力。骨组织染色：将大鼠股骨组织分离，取股骨上端标本，4%多聚甲醛固定24 h，脱钙液充分脱钙1个月，每周更换1次。石蜡包埋，制作切片，HE染色，显微镜下观察。

1.6 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（）表示，组间或组内数据比较采用t检验；采用χ2检验进行计数资料的比较，以n（%）表示计数资料。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠骨转化指标比较 见表1。与空白组比较，模型组血清TrACP、CTX-1均明显升高，ALP、OC均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠TrACP、CTX-1均明显降低，ALP、OC均明显升高（P＜0.05）；与西药组比较，高剂量组各指标均明显改善（P＜0.05）。

表1 各组大鼠骨转化指标比较（±s）

表1 各组大鼠骨转化指标比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。下同

组别空白组模型组西药组低剂量组中剂量组高剂量组n 9 9 8 8 9 9 TrACP（ng/mL）43.49±1.21 54.65±3.93*47.04±2.02*▲49.63±2.78*▲46.85±1.86*▲44.48±1.63▲△CTX-1（μmol/L）10.35±3.19 193.31±43.42*30.27±4.36*▲34.17±4.88*▲26.74±4.03*▲21.52±3.41▲△ALP（pg/mL）59.86±1.47 40.07±1.45*51.74±1.29*▲48.75±1.32*▲53.68±1.26*▲57.59±1.02▲△OC（pg/mL）337.20±26.78 239.97±30.26*291.46±20.53*▲278.82±18.39*▲300.28±21.64*▲311.28±17.71▲△

2.2 各组大鼠脑骨密度比较 见表2。与空白组比较，模型组BMD、TMD均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠BMD、TMD均显著增加（P＜0.05）；与西药组比较，高剂量组BMD、TMD增加明显（P＜0.05）。

表2 各组大鼠脑骨密度比较（g/cm3，±s）

表2 各组大鼠脑骨密度比较（g/cm3，±s）

组别空白组模型组西药组低剂量组中剂量组高剂量组n998899 BMD 0.38±0.03 0.23±0.02*0.29±0.02*▲0.27±0.02*▲0.31±0.01*▲0.34±0.02▲△TMD 0.85±0.02 0.73±0.01*0.79±0.02*▲0.77±0.01*▲0.80±0.02*▲0.82±0.02▲△

2.3 各组大鼠股骨骨形态计量学指标比较 见表3。与空白组比较，模型组TbAr%、Tb.N、Tb.Th明显减少，Tb.Sp明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠TbAr%、Tb.N、Tb.Th明显增加，Tb.Sp明显减少（P＜0.05）；与西药组比较，高剂量组各指标显著改善（P＜0.05）。

表3 各组大鼠股骨骨形态计量学指标比较（±s）

表3 各组大鼠股骨骨形态计量学指标比较（±s）

组别空白组模型组西药组低剂量组中剂量组高剂量组n 9 9 8 8 9 9 TbAr%23.35±5.78 15.59±4.41*20.03±5.16*▲18.97±5.42*▲20.54±5.17*▲21.79±6.18▲△Tb.N（个/mm2）5.69±0.42 4.28±0.63*5.11±0.45*▲4.93±0.54*▲5.16±0.48*▲5.32±0.46▲△Tb.Th（μm）79.36±8.57 50.71±9.32*64.82±7.91*▲60.26±8.13 68.34±8.38*▲71.49±7.48▲△Tb.Sp（mm）0.20±0.01 0.31±0.03*0.25±0.02*▲0.26±0.01*▲0.23±0.02*▲0.22±0.01▲△

2.4 各组大鼠骨生物力学指标比较 见表4。与空白组比较，模型组最大载荷、最大挠度、最大应力均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组最大载荷、最大挠度、最大应力均明显升高（P＜0.05），与西药组比较，高剂量组各指标均升高明显（P＜0.05）。

表4 各组大鼠骨生物力学指标比较（±s）

表4 各组大鼠骨生物力学指标比较（±s）

组别空白组模型组西药组低剂量组中剂量组高剂量组n 9 9 8 8 9 9最大载荷（N）150.06±19.85 124.64±16.96*134.58±17.17*▲135.88±16.21*▲138.23±16.16*▲142.63±17.82▲△最大挠度（mm）1.82±0.33 1.27±0.24*1.48±0.31*▲1.49±0.28*▲1.56±0.26*▲1.69±0.27▲△最大应力（MPa）13.96±0.54 9.58±0.69*10.65±0.44*▲10.39±0.41*▲11.04±0.58*▲11.29±0.47▲△

2.5 各组大鼠骨组织形态比较 见图1。模型组骨小梁明显变细、稀疏；各治疗组大鼠骨小梁较模型组明显增加。

图1 各组大鼠骨组织形态比较（HE染色，100倍）

3 讨论

GIOP属于继发性骨质疏松，GC可直接作用于成骨细胞、破骨细胞和骨细胞，通过促进破骨细胞生成，延长其生存时间以促进骨吸收，诱导成骨细胞和骨细胞凋亡、抑制成骨细胞分化和降低成骨功能等以抑制骨形成，同时抑制Ⅰ型胶原合成，阻碍其与非胶原蛋白结合，使骨丢失加快、骨增殖能力下降，最终引起骨质疏松。骨折是骨质疏松的常见并发症之一，GIOP患者在服用GC的3～6个月内，骨折发生率明显增加［2］，多见于椎骨、腕部及髋部，以髋部骨折发生率最高。

骨代谢评价包括骨量和骨质量两个主要方面。骨密度是反映骨量的有效指标，与骨折危险程度密切相关，也是诊断骨质疏松的必要条件［3］。CTX-1是Ⅰ型胶原的降解产物，所具有的特异性结构使其在血清中有较佳的稳定性，因此，血清CTX-1水平能特异性反映破骨细胞的吸收活性［4］。TrACP是由破骨细胞分泌的非胶原蛋白，和胶原代谢产物一起被分泌到细胞外，故TrACP与骨吸收水平成正相关［5］。ALP和OC均由成骨细胞产生，前者是总碱性磷酸酶的重要组成部分，后者是骨基质中含量最丰富的标志物，二者均反映骨形成状态［6-7］。骨组织形态学是研究骨组织结构和骨量等静态特性；骨生物力学则是骨强度、骨结构、骨量的综合体现，其中骨结构力学强度是反映骨质疏松性骨折风险的最有效指标，三点弯曲试验是常用的测量方法，最大载荷反映骨的刚度，最大应力反映骨质的内在硬度。骨生物力学性能降低是骨折发生的重要原因之一，同时也是评价药物治疗骨质疏松疗效的重要指标［8］。

在中医学上，GIOP 属于“骨痿”“骨痹”“骨枯”范畴。中医学认为，骨质疏松的发病以肾虚为本，病机为肾虚精亏，骨空失养，阴阳两虚；治疗原则以补肾壮骨填精为主，补肝脾、活血化瘀为辅［9］。本方中淫羊藿、菟丝子、杜仲补肝肾、强筋骨、益精壮阳；续断、骨碎补补肝肾、强骨壮筋、续折伤；熟地黄补血养阴、填精益髓；丹参、红花、当归、牛膝活血化瘀、通经止痛；山药补脾益肾；茯苓健脾安神；龙骨镇心安神，平肝潜阳；川芎活血散瘀，祛风止痛；独活通痹止痛；甘草补脾气、调和诸药，全方共奏补肾壮骨、活血化瘀之功效。现代药理学研究证实［10-11］：牛膝总皂苷可升高骨质疏松大鼠碱性磷酸酶活性和血清骨钙素水平，改善骨代谢；骨碎补总黄酮能提高血钙、血磷水平，激活成骨细胞，明显增加骨小梁宽度和密度，减少骨小梁间隙［12］；杜仲可降低骨折早期的血钙水平，升高血磷，促进骨折断端矿物质沉积，促进骨痂生长和骨折愈合；续断可以调节骨形成和骨吸收指标，降低骨转换率，增加骨密度，改善骨小梁微结构，提高股骨强度，降低骨折风险；丹参可预防骨质疏松，以预防松质骨为主，可显著增加BMD，降低磷含量［13-16］。

在本研究中，各治疗组大鼠TrACP、CTX-1、Tb.Sp均明显降低，ALP、OC、BMD、TMD、TbAr%、Tb.N、Tb.Th、最大载荷、最大挠度、最大应力均明显升高；活血补肾壮骨方高剂量组各项指标均改善明显。因此我们认为，活血补肾壮骨方能显著升高GIOP大鼠的血清ALP、OC含量，降低TrACP、CTX-I水平，增加BMD、Tb.N缩小骨小梁间隙，改善骨显微结构，增强骨强度，提升骨生物力学性能，从而有效促进骨折愈合，对抗糖皮质激素的致骨质疏松作用，改善GIOP症状，保护骨组织。