基于细胞凋亡探讨搜风祛痰方对心肌缺血再灌注大鼠冠脉微循环的影响*

金颂峰 宫丽鸿 肖福龙 吕 童

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110079；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

近年来，由于急性冠脉综合征入院的患者中，约40%其冠脉造影结果未见明显异常，这与心外膜冠状动脉无狭窄被认为不存在缺血的观点不相吻合，说明可能存在着冠脉微循环障碍（CMD）［1］。有充分证据说明，心肌缺血再灌注损伤中存在着血管内皮细胞凋亡［2］，且细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤呈正比，这是造成血管内皮功能障碍［3］，导致CMD发生的主要原因［4］。如何减少心肌细胞凋亡已成为心肌保护的研究热点之一。前期研究结果表明［5-6］搜风祛痰方具有保护血管内皮功能的作用。因此，本研究将基于该结论进一步探讨搜风祛痰方对大鼠心肌缺血再灌注损伤冠脉微循环内皮细胞凋亡的影响，明确搜风祛痰方保护血管内皮功能进而治疗CMD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SPF级SD大鼠140只，8周龄，体质量（240±20）g，编号：21000092018010［长生生物，许可证号：SYXK（辽）2013-0009］。辽宁中医药大学动物实验中心饲养，温度20～25℃，相对湿度40%～70%，每日光照12 h，自由摄食饮水。

1.2 实验药物 搜风祛痰方：蜈蚣1条，全蝎5 g，白术15 g，水蛭15 g，陈皮15 g，地龙20 g，法半夏15 g。由辽宁省中医院制成含生药2 g/mL的中药浓缩液。培哚普利片（施维雅制药，国药准字号：H20034053，4 mg/片）。

1.3 试剂与仪器 前列环素（PGI2）、血栓素A2（TXA2）试剂盒（AMEKO）；4%多聚甲醛固定液（碧云天生物，P0099-100mL）；柱式RNA提取试剂盒（生工生物）；反转录试剂盒（诺唯赞）；微量核酸蛋白测定仪（柏点）；PCR扩增仪（赛默飞）；高通量组织研磨仪（莱驰，型号：MM400）；小动物呼吸机（HX-100E型号，成都泰盟科技有限公司）；荧光定量PCR仪（Agilent Technologies）。

1.4 分组与给药 适应性喂养大鼠7 d，随机分为4组：假手术组、模型组、西药组、中药组，每组35只。假手术组、模型组给予10 mL/kg生理盐水，中药组（依照前期研究结果［5］）给予8.1 g/kg搜风祛痰方，西药组给予0.4 mg/kg培哚普利片，连续灌胃7 d。

1.5 造模方法 参考文献［7］方法，末次灌胃1 h后，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠。插入电极监测心电图，置入气管导管，接呼吸机。剃毛消毒大鼠左侧胸壁，将第三四肋间皮肤横切口切开，使心脏充分暴露。在左心耳下距根部2～3 mm处结扎左前降支及少量心肌组织，闭合胸腔。结扎成功后可见心电图R波增宽、ST段抬高。缺血30 min后剪开结扎线，再灌注120 min。造模成功的标志为抬高的ST段下降1/2以上。假手术组与其他3组手术过程相同，但不结扎。

1.6 标本采集与检测 采集前夜大鼠需禁食。通过腹主动脉取血，静置离心，取上清液，在-20℃中保存。将大鼠立即处死，无菌环境摘取心脏，由4%多聚甲醛固定后放入液氮中，-20℃冻存。1）心电图。麻醉大鼠，仰卧固定，插入电极，在缺血及再灌注时进行监测。2）ELISA法测定PGI2、TXA2含量。3）RT-PCR法测Bax mRNA、Bcl-2 mRNA。提取总RNA后反转录合成cDNA，构建荧光PCR反应体系，进行扩增反应。Bax引物序列为上游为5′-GGGCCTTTTTGCTACAGG GT-3′，下游为 5′-TTCTTGGTGGATGCGTCCTG-3′，长度为106 bp。Bcl-2引物序列为上游为5′-GGATCCAGGATAACGGAGGC-3′，下游为 5′-ATGCACCCAGAGTGATGCAG-3′，长度为141 bp。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0软件。计量资料以（）表示。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 共成功建立模型大鼠42只，其中模型组16只，西药组12只，中药组14只。假手术组大鼠25只。

2.2 各组大鼠PGI2、TXA2含量比较 见表1。相比假手术组，模型组TXA2含量增加，PGI2含量减少（P＜0.05）；相比模型组，西药组和中药组PGI2含量升高，TXA2含量下降（P＜0.05）。

表1 各组大鼠PGI2、TXA2含量比较（ng/L，±s）

表1 各组大鼠PGI2、TXA2含量比较（ng/L，±s）

与假手术组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同

n组别假手术组模型组西药组中药组25 16 12 14 PGI2 68.484±1.950 32.440±1.918▲58.257±5.934△54.507±5.351△TXA2 35.141±0.711 62.258±5.785▲42.471±1.012△49.514±3.426△

2.3 各组大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达比较 见表2。相比假手术组，模型组Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达均升高（P＜0.05）；相比模型组，西药组和中药组Bcl-2 mRNA表达升高，Bax mRNA表达下降（P＜0.05）。

表2 各组大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达水平比较（±s）

组别假手术组模型组西药组中药组n 25 16 12 14 Bcl-2 mRNA 1.001±0.053 1.855±0.114▲3.594±0.571△3.618±0.224△Bax mRNA 1.008±0.160 3.006±0.290▲1.853±0.211△1.706±0.164△

3 讨论

CMD是指在各种致病因素的作用下冠脉微血管的固有结构及功能出现异常，引发心肌细胞灌注不足而出现以心肌缺血为主要症状的一种临床综合征［8］。该病涉及人群广泛，其发病可引起冠心病不良事件的发生，并影响其发展、治疗和预后，从而导致急性心血管事件的发生甚至引起死亡［9］。研究发现［10］，导致CMD发生的原因有血管内皮功能障碍、炎症反应、氧化应激等方面，其中由血管内皮功能障碍所引起的CMD最为常见。近年来，心肌缺血再灌注损伤中的细胞凋亡所引起的血管内皮功能障碍已被越来越多的实验所证明［11］。因此，从抑制细胞凋亡的角度保护血管内皮功能是保证冠脉微循环稳定、治疗CMD不可替代的基础。

根据CMD的临床表现，可将其归属为中医学“胸痹”范畴。现代人嗜食肥甘，导致脾气虚弱，健运失施，水湿内阻，聚湿生痰。痰凝可致血瘀，二者胶结而生内热，进而热盛风动，导致脉络绌急，这就与CMD血管栓塞痉挛的发病机制相似［5］。故治以搜风祛痰方，作搜内风、消痰瘀、通脉络之用。方中全蝎、蜈蚣与地龙共为君药，可清热息风镇痉、通络散结；陈皮、半夏与白术共为臣药，可燥湿化痰、宽胸散结；水蛭为佐药，可破血消瘀通络。全方共奏搜风祛痰、祛瘀通络之效。药理方面，全蝎、蜈蚣与地龙具有保护内皮、抗凝、改善血运等功能［12-14］；陈皮、半夏与白术具有抗炎、抗血栓、抗心律失常和抗氧化等功效［15-17］；水蛭具有抗凋亡、预防血栓等功效［18］。

培哚普利片具有持续时间长、耐受性好、无不良影响等优点，可扩张血管、加快修复病变小动脉、减少血容量、降低血管阻力，有效改善血流动力学［19］，故选用其为本实验阳性对照药物。Bcl-2和Bax是目前公认的一对调控凋亡的关键基因［20］。心肌缺血再灌注损伤时，Bax通过降低Bcl-2表达并升高细胞内Ca2+，导致细胞凋亡；而Bcl-2则通过抗氧化剂或抑制氧自由基生成，改变细胞内Ca2+外流，调节细胞内cGMP含量，抑制细胞凋亡［21］。研究发现［22］，Bcl-2和Bax含量的增高与缺血再灌注过程中心肌细胞的反应性表达、提高细胞内在抵抗力相关。本实验结果显示：相比假手术组，模型组Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达上升。说明心肌缺血再灌注损伤时出现细胞凋亡；相比模型组，中药组Bcl-2 mRNA表达上升，Bax mRNA表达降低。说明搜风祛痰方具有抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤冠脉微循环内皮细胞凋亡的作用。PGI2与TXA2是一对具有调控血管舒缩与血小板聚集作用的相互拮抗的前列腺素因子，由血管内皮细胞分泌［23］。因此，PGI2和TXA2的不平衡与冠脉微循环内皮功能障碍的发生有密切关系。本实验结果显示：相比假手术组，模型组PGI2含量下降，TXA2含量上升。说明心肌缺血再灌注损伤发生时出现冠脉微循环内皮功能障碍；相比模型组，中药组TXA2含量明显降低，PGI2含量明显升高。说明搜风祛痰方可有效调节血管收舒平衡，保护内皮功能。

综上所述，搜风祛痰方可上调Bcl-2 mRNA表达，下调Bax mRNA表达，调节PGI2与TXA2的含量，通过抑制血管内皮细胞的凋亡保护大鼠心肌缺血再灌注冠脉微循环内皮功能，实现对CMD的治疗作用。