四神丸对腹泻型肠易激综合征大鼠脊髓Ghrelin、GHSR表达的影响*

蔺晓源 邓 娜 夏旭婷 蔡 莹 刘富林

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

中医经典名方四神丸临床用于治疗腹泻型肠易激综合征（IBS-D）效果显著［1-2］，但其作用靶点却不清楚。IBS-D以反复发作的腹部不适、腹痛、腹泻为主要表现，发病机制尚不明确，至今亦无最佳治疗方案，虽不会严重威胁患者生命，但其症状迁延反复，对患者生活质量造成的影响远比器质性疾病更严重［3］。目前一致认为，基于脑肠肽作用的脑肠轴调控紊乱在IBS-D的发病中起重要作用［4］。胃促生长素（Ghrelin）是一种重要的兴奋性脑肠肽，Ghrelin及其受体GHSR在胃肠道、下丘脑、脊髓中均有分布，并在IBS-D的发病中起关键作用［5］。为了进一步明确四神丸治疗IBS-D的中枢神经机制，本研究观察了其对IBS-D模型大鼠脊髓组织Ghrelin、GHSR表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠60只，SPF级，雄性，体质量（200±20）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2016-002。饲养温度21～25℃，湿度50%～70%。

1.2 实验药物

四神丸（北京同仁堂天然药物唐山有限公司，国药准字Z13020656；主要成分为肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸、大枣）研磨后用纯净水配成高、中、低质量浓度（0.732、0.366、0.183 g/mL）的药液备用。得舒特（法国苏威制药公司，注册证号H20120127）用纯净水配成质量浓度为1.523 mg/mL的药液备用。番泻叶（购自湖南中医药大学第一附属医院中药药房，经鉴定符合国家药典标准）按100 g加沸水400 mL比例浸泡30 min后再煮3 min，浓缩成1.0 g/mL的水煎液备用。

1.3 试剂与仪器

Ghrelin、GHSR鼠抗多克隆抗体（Abcam），SP-9000免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），逆转录试剂盒（TAKARA），PCR试剂盒（KAPA Biosystems）。3050S冷冻切片机（徕卡），IX71显微镜和图像分析系统（奥林巴斯），Realplex2荧光定量PCR仪（Eppendorf），T100梯度PCR扩增仪、Cheemi-Doc XRS+Imager化学发光系统（美国BIO-RAD）。

1.4 分组与造模

大鼠适应性喂养1周后，随机取10只作为正常组，其余50只参考文献方法采用番泻叶灌胃+避水应激方法建立脾肾阳虚型IBS-D大鼠模型［6］：造模动物给予番泻叶水煎液灌胃（10 mL/kg），每天1次，连续28 d后开始进行避水应激。取一透明玻璃水槽，中央有一岛样小平台，水槽内注满水，距平台面下1 cm，每天上午9∶00～11∶00将造模大鼠置于平台上，每天1 h，连续10 d。造模成功后再随机分为模型组、得舒特组和四神丸高、中、低剂量组，每组10只。

1.5 给药方法

模型组灌胃纯净水，得舒特组灌胃成人等效剂量（15.23 mg/kg）的得舒特药液，四神丸高、中、低剂量组灌胃成人等效剂量4、2、1倍剂量（7.32、3.66、1.83 mg/kg）的四神丸药液，灌胃体积量均为10 mL/kg，灌胃14 d，正常组常规饲养。

1.6 标本采集与检测

最后1次灌胃后水合氯醛麻醉大鼠，冰盒上剖开腹腔，剪取脊椎，其中一小段剥离出脊髓，用生理盐水漂洗后装入冻存管中置-80℃冰箱中保存，另一小段放入多聚甲醛中固定后脱钙。

1.6.1 免疫组化法检测脊髓组织Ghrelin、GHSR的阳性表达 每组随机取出5个标本，0TC包埋，冰冻切片机连续切片。切片放入3% H2O2去离子水孵育10 min，PBS洗3次；滴加100 μL正常山羊血清室温孵育15 min；加入Ghrelin、GHSR抗体，之后按SP-9000免疫组化染色试剂盒说明书加入SP-9000二抗工作液、辣根酶标记链霉卵白素工作液后AEC显色、贴片、封片。显微镜下拍摄200倍图像，选取400倍镜下阳性表达不重复的5个视野拍片，计算免疫阳性细胞的平均数。

1.6.2 RT-PCR检测脊髓组织Ghrelin、GHSR的mRNA表达 每组随机取出3个标本，根据RT-PCR的操作方法进行3复孔操作。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如下：Ghrelin-F：GGTGTCTTCAGCGACTATCT，Ghrelin-R：TGGTGGCTTCTTGGATT，扩增片段大小133 bp；GHSR-F：CTACGCCACGGTCCTCA，GHSR-R：CTTCACGCGGCCCTTA，扩增片段大小103bp；β-Actin-F：CGTTGACATCCGTAAAGAC，β-Actin-R：TAGGAGCCAGGGCAGTA，扩增片段大小110 bp。数据采用仪器自带软件分析。

1.7 统计学处理

应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脊髓组织中Ghrelin、GHSR阳性表达的比较

见表1，图1～图2。Ghrelin、GHSR在正常组有少量表达，主要集中于脊髓H形的灰质中，阳性细胞呈红褐色，以点状和条索状多见。模型组Ghrelin、GHSR阳性细胞数较正常组显著增多（P＜0.01）；与模型组比较，四神丸高、中、低剂量组和得舒特组Ghrelin、GHSR阳性表达均减少（P＜0.05或P＜0.01）；且对Ghrelin表达的影响，四神丸高剂量组和得舒特组优于低剂量组（P＜0.05），四神丸高、中剂量组与得舒特组比较差异不显著（P＞0.05）；而对GHSR表达的影响，四神丸高剂量组优于低剂量组（P＜0.05），而四神丸中、低剂量组与得舒特组比较，差异不显著（P＞0.05）。

表1 各组大鼠脊髓组织中Ghrelin、GHSR阳性细胞数比较（个/mm2，±s）

表1 各组大鼠脊髓组织中Ghrelin、GHSR阳性细胞数比较（个/mm2，±s）

与正常组比较，#P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与四神丸低剂量组比较，*P＜0.05。下同

组别正常组模型组得舒特组四神丸高剂量组四神丸中剂量组四神丸低剂量组n 5 5 5 5 5 5 Ghrelin 6.41±2.94 16.27±4.36#11.16±3.50△*10.78±3.17△△*12.29±3.68△14.04±4.12△GHSR 4.27±1.83 9.07±2.42#6.85±2.37△5.20±1.96△△*6.49±2.31△7.30±2.68△

图1 各组脊髓Ghrelin阳性细胞表达（AEC显色，200倍）

图2 各组脊髓GHSR阳性细胞表达（AEC显色，200倍）

2.2 各组大鼠脊髓组织中Ghrelin、GHSR mRNA表达比较

见表2。模型组脊髓Ghrelin、GHSR mRNA表达较正常组明显增高（P＜0.01）；四神丸高、中剂量组均能下调脊髓Ghrelin、GHSR的mRNA表达，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但与低剂量组和得舒特组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠脊髓组织中Ghrelin、GHSR mRNA表达比较（±s）

表2 各组大鼠脊髓组织中Ghrelin、GHSR mRNA表达比较（±s）

组别正常组模型组得舒特组四神丸高剂量组四神丸中剂量组四神丸低剂量组n 3 3 3 3 3 3 Ghrelin 1.17±0.27 1.52±0.30#1.40±0.31 1.33±0.21△1.38±0.25△1.42±0.30 GHSR 1.04±0.16 1.33±0.28#1.22±0.23 1.16±0.20△1.19±0.19△1.24±0.25

3 讨论

脑肠轴调控障碍在IBS-D的发病中起着非常重要的作用，通过兼具神经递质与内分泌激素双重身份的脑肠肽在外周和中枢水平形成一个协调统一的整体，调节着胃肠运动、感觉、分泌等复杂功能［7-8］。正是基于以上认知，2016年5月罗马Ⅳ标准将包括IBS-D在内的功能性胃肠病，重新定义为脑-肠互动异常。Ghrelin在胃肠道和中枢神经系统均有分布。Ghrelin的受体GHSR主要分布于下丘脑、胃肠道平滑肌组织和神经丛，另外在迷走神经和脊髓亦发现有GHSR的存在［9］。Ghrelin可剂量依赖性地促进大鼠小肠转运，可通过中枢和外周机制促进胃肠运动［10］。研究发现，功能性胃肠病肝郁脾虚模型大鼠Ghrelin蛋白在下丘脑、脊髓、胃窦和结肠部位表达下降，胃排空及小肠推进明显减慢［11］。肝郁脾虚型功能性消化不良大鼠脊髓组织中的Ghrelin蛋白表达也明显低于空白组［12］。IBS-D模型大鼠血清Ghrelin水平显著升高［4］。小鼠胃排空的延迟与GHSR的缺乏有关［13］。

IBS-D属中医学“泄泻”范畴，病位在肠，脾失健运是其发病关键，同时与肾脏关系密切，后世明确提出了脾肾阳虚的五更泄泻。有学者通过研究泄泻的中医证型及其证候分布规律发现，脾肾阳虚证在泄泻中的证型比例为9.21%［14］。基于“脾肾相关”理论，治当益火补土。《内科摘要》所载四神丸为治疗脾肾阳虚泄泻的经典名方剂，诸多研究证实，其临床用于治疗IBS-D效果显著，Meta分析结果也表明，四神丸治疗IBS-D临床有效率优于西药组，且四神丸安全性更高［15］。课题组前期研究发现，四神丸对脾肾阳虚泄泻模型大鼠的作用机制可能与调节脑肠肽Ghrelin信号通路指标的表达有关［16］，可明显改善模型大鼠血清Ghrelin水平，及其在下丘脑、胃肠中的表达［17-19］。

本研究结果显示，模型组大鼠脊髓组织中Ghrelin、GHSR的阳性细胞数均较正常组显著增多，Ghrelin、GHSR的mRNA表达也均较正常组显著升高，说明脾肾阳虚泄泻大鼠中枢神经系统出现了Ghrelin及其受体表达水平的紊乱。经给药治疗后，四神丸高、中、低剂量均能下调脊髓Ghrelin、GHSR的阳性细胞数，四神丸高、中剂量均能下调脊髓Ghrelin、GHSR的mRNA表达，说明四神丸下调模型大鼠脊髓Ghrelin、GHSR的表达具有剂量依赖性。以上研究结果提示，四神丸对脾肾阳虚型泄泻大鼠的作用与降低脊髓中Ghrelin、GHSR的表达有关，这可能是其治疗脾肾阳虚型泄泻的中枢作用机制之一。