龙生蛭胶囊抗凝、抗血栓作用的实验研究*

陈海红 陈 冰 张弈舒 陈思邈 林敏秋 陈伟燕 张宇燕△

（1.浙江省杭州市中医院，浙江 杭州 310007；2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

血栓是由血小板大量聚集形成，脑缺血的发生与血栓的形成有着密不可分的关系。当血管中的纤维蛋白、血小板、白细胞和红细胞异常聚集在一起，使血管壁变得狭窄，血流量减少，从而造成了缺血的症状［1］。而脑缺血则是缺血性疾病中最为危险的一种。脑缺血是一种病因复杂的疾病，许多因素例如高血压、脑内肿瘤、低血糖、脑出血等等都有可能发展为脑缺血疾病。脑缺血发生的病因诸多，目前没有特效治疗药，但通过减少或抑制血栓的形成，对治疗缺血性疾病有着重要的作用［2-3］。

龙生蛭胶囊是在补阳还五汤的基础上所制成的，共含有12味中药，以黄芪、水蛭为君，当归、红花、赤芍、桃仁和红花为臣药，桑寄生、刺五加和石菖蒲为佐，木香、地龙共为使药。龙生蛭胶囊的主要药理功效为补气活血，逐瘀通络。《本草新编》中载黄芪“其功用甚多，而其独效者，尤在补血”“黄芪用之于当归之中，自能助之以生血也”，称其为“补气之圣药”，这也是龙生蛭胶囊增补气血，活络血液的功效所在。《神农本草经》中记载水蛭“水蛭主逐恶血、瘀血，月闭、破血瘕积聚”，表明了水蛭具有逐血瘀，溶血栓的作用。地龙能够抑制血小板集合，还能溶解血栓。当归和赤芍的配伍也具有改善血流，减少血栓形成的作用［4］。这正是龙生蛭胶囊能够抗血栓、抗凝的基础所在，并且目前也有许多文献报道了龙生蛭胶囊在抗血栓、抗凝中有着重要的作用［5-7］。本文采用体内外实验观察龙生蛭胶囊的抗凝、抗栓作用，为其治疗心脑血管病的临床用药提供科学依据，有助于临床合理使用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级雄性SD大鼠，体质量（280±10）g；昆明种小鼠，雌鼠和雄鼠各半，体质量为16～22 g。动物均购自浙江中医药大学动物实验研究中心，合格证号：SYXK（浙）2018-0012。

1.2 实验药物

龙生蛭胶囊，陕西省咸阳市步长药业有限公司生产，国药准字：Z20010059，成分为黄芪、水蛭、当归、红花、赤芍、桃仁、红花、桑寄生、刺五加、石菖蒲、木香、地龙；阿司匹林片，拜耳医药公司。其余试剂均为分析纯。

1.3 龙生蛭胶囊体外抗凝纤溶作用研究

1.3.1 龙生蛭胶囊对纤维蛋白溶解活性的影响 1）试液配制。0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）的制备：精密称取0.0904 g的NaH2PO4和0.3276 g的Na2HPO4，加入20 mL蒸馏水，使两者充分溶解，即可得到磷酸缓冲液。20 μ/mL凝血酶液的制备：取1 mL配置好的0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）放入小试管中，再称取0.004 g凝血酶加入小试管，摇晃至充分溶解。龙生蛭溶液的配制：取龙生蛭胶囊，加纯化水溶解，分别配制成0.5、1、2 g/L质量浓度梯度的龙生蛭药液。2）纤维蛋白平板的制备。取4.5 mL纤维蛋白原溶液置于平皿中，加入0.5 mL的凝血酶液，立即旋转使其混合均匀，盖上平皿盖衬以滤纸，水平放置1 h。3）实验步骤。取10 μL不同质量浓度的龙生蛭药液滴加到制备好的纤维蛋白平板上，每一点龙生蛭药液之间的距离不得小于1.5 cm，再取10 μL生理盐水滴在另一侧，作为对照。将纤维蛋白平板水平放置于湿盒中，放进37℃恒温箱中恒温保存6 h，观察溶液周围溶解圈的形成，卡尺测量溶解圈的长、短径，最后计算面积，并以溶解圈面积大小为标准，标定纤溶活性的强弱。不同质量浓度的龙生蛭药液均重复10次实验，各组取平均值。溶解圈面积（mm2）=［（长径+短径）/4］2×π。

1.3.2 龙生蛭胶囊对大鼠血浆复钙时间（PRT）的影响

1）对照组血浆复钙时间：取3个离心管，并在3个离心管均加入0.1 mL SD大鼠血浆和0.1 mL生理盐水，混合均匀后立即置于37℃水浴中，1 min后取出，然后分别加入0.1 mL氯化钙溶液，完全混合后再次置于37℃水浴中，并同时使用计时器计时。记录从加氯化钙溶液到纤维蛋白形成所需的时间，计算3个离心管中纤维蛋白形成时间的平均值，即为对照组的血浆复钙时间。

2）给药组血浆复钙时间：将对照组中的生理盐水换成梯度质量浓度龙生蛭药液（质量浓度为1、2、4、6、8 g/L），其余条件均不改变，计算不同质量浓度的龙生蛭药液的血浆复钙时间，即为给药组血浆复钙时间。

1.3.3 龙生蛭胶囊对凝血酶原时间（PT）的影响 取玻璃试管6支，每支均加入0.05 mL凝血活酶、0.05 mL氯化钙溶液、0.05 mL SD大鼠血浆，编号为1～6，在前5支玻璃试管中按照编号依次加入0.05 mL质量浓度1、2、4、6、8 g/L的龙生蛭药液，在最后一只玻璃试管（编号为6）中加入0.05 mL生理盐水，作为对照组。混合均匀后置于37℃水浴中，并开始计时。每2～3s慢慢地将试管倾斜1次。记录玻璃试管中液面保持不动所需的时间，即为纤维蛋白凝固所需的时间。每组重复10次，并取平均值。

1.4 龙生蛭胶囊对正常小鼠体内抗凝、抗栓作用的研究

1.4.1 分组方法 将昆明种小鼠随机分成5组，雌雄各半，每组10只，分别为正常组、龙生蛭胶囊低、中、高剂量组（1.32、2.64、5.28 g/kg）、阳性药对照组（阿司匹林1.3 mg/kg），正常组灌胃等量生理盐水，各组其余的饲养条件都相同，连续灌胃给药7 d，每天1次。

1.4.2 龙生蛭胶囊对正常小鼠尾部凝血时间的影响 在最后1次灌胃结束1 h后，剪断小鼠的1 cm尾尖，使血液能够自动流出。第1滴血用滤纸擦干后，滴两滴于洁净载玻片的两端，用干燥的6号针头沿血滴的外缘向内里慢慢地挑动，直至6号针头能挑起纤维蛋白丝为止，即计为小鼠尾尖凝血时间。

1.4.3 龙生蛭胶囊对正常小鼠凝血系统的影响 最后1次灌胃结束1 h后，用眼科镊摘除小鼠眼球取血，3.8%枸橼酸钠抗凝，1 500 r/min离心5 min，按照试剂盒说明书操作，分别测定小鼠凝血酶时间（TT）、PT、纤维蛋白原（FIB）水平、活化部分凝血酶原时间（APTT）。

1.5 统计学处理

应用SPSS25.0统计软件。计量资料以（）表示，进行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为具有极显著性差异。

2 结果

2.1 龙生蛭胶囊体外抗凝纤溶的作用

2.1.1 龙生蛭胶囊对纤维蛋白（平板）溶解活性的影响 见表1。与生理盐水组比较，不同剂量的龙生蛭药液均能促进纤维蛋白块的溶解，且龙生蛭胶囊对于加热纤维蛋白平板（破坏纤溶酶原）溶解无促进效果，表明龙生蛭药液缺乏纤溶酶活性，它是通过激活纤溶酶原，使纤溶酶原转变为具有活性的纤溶酶，从而促进了纤维蛋白块的溶解。同时实验结果也表明，龙生蛭胶囊质量浓度越大，纤维蛋白（平板）溶解面积最大，对纤维蛋白溶解活性越强。

表1 龙生蛭胶囊对纤维蛋白（平板）溶解活性的影响

2.1.2 龙生蛭胶囊体外对大鼠PRT的影响 见表2。与生理盐水组比较，龙生蛭药液不同质量浓度均能延长大鼠PRT，具有抑制血浆复钙的作用，且随着龙生蛭药液质量浓度升高，血浆凝固时间越长，其中质量浓度8 g/L的龙生蛭药液的血浆凝固时间最长。

表2 龙生蛭胶囊体外对大鼠PRT、PT的影响（s）

2.1.3 龙生蛭胶囊体外对大鼠PT的影响 见表2。与生理盐水组比较，龙生蛭药液不同质量浓度均能延长PT，抗凝效果明显，其中以6 g/L的龙生蛭药液的抗凝效果更为明显。体外抗凝纤溶的作用研究表明，龙生蛭胶囊能促进纤维蛋白块溶解，延长血浆复钙时间，能延长体外PT，具有较好的体外抗凝作用。

2.2 龙生蛭胶囊对正常小鼠体内抗凝、抗栓的影响

2.2.1 龙生蛭胶囊对正常小鼠尾部凝血时间的影响见表3。与正常生理盐水组比较，龙生蛭胶囊低、中、高剂量组均能明显延长正常小鼠尾部血液凝固时间（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 龙生蛭胶囊对正常小鼠尾部凝血时间的影响（s，±s）

表3 龙生蛭胶囊对正常小鼠尾部凝血时间的影响（s，±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同

组别正常组龙生蛭低剂量组龙生蛭中剂量组龙生蛭高剂量组阿司匹林组n 10 10 10 10 10凝血时间127.25±28.32 153.05±48.27*162.20±52.04**188.30±53.91**138.05±42.68

2.2.2 龙生蛭胶囊对正常小鼠凝血4项指标的影响见表4。与正常组比较，龙生蛭胶囊能延长TT和PT，一定程度上延长活化部分APTT，能明显提高血浆中FIB水平，且均具有剂量相关性，表明龙生蛭胶囊能使正常小鼠的凝血时间延长，具有较好的抗血栓和抗凝的功效。

3 讨 论

近年来，脑缺血的发病率有逐年攀升的趋势，且死亡率也在逐年增加［2］。其中血栓是导致脑缺血发生的重要原因。血小板的活化并聚集，造成脑血管堵塞并最终形成了脑血栓，从而发展成了脑缺血疾病［8］。因此，减少脑血栓的形成对于治疗脑缺血有很大的帮助。目前脑血管病治疗手段有溶栓治疗、阿司匹林口服和抗凝治疗等［9］。单纯西医在基础研究方面取得了较大进展，常采用溶栓、降纤、抗凝、脑保护等治疗，虽可降低患者死亡率，但无法调控其发病率、致残率以及复发率，临床治疗进展不大，后期恢复并无良方，尚无修复性治疗方法，功能恢复非常有限，许多患者可能会遗留有大脑某些功能的永久性损害［10］。随着中医药的发展，利用中西医结合手段进行脑血管疾病的诊疗疗效颇丰。临床实践表明，中医药在脑血管疾病的理论、方法、效果、成本等方面具有明显的应用优势，发挥中医简、效、廉、便的特色，必将是我国脑血管病临床实践的必然趋势［11-12］。中药复方相对于单一成分为主的西药，可发挥多成分、多靶点、多途径的整合治疗作用，发挥整体药效，恢复人体多系统相互作用的稳态平衡。

表4 龙生蛭胶囊对正常小鼠凝血4项指标的影响（±s）

表4 龙生蛭胶囊对正常小鼠凝血4项指标的影响（±s）

n组别正常组龙生蛭低剂量组龙生蛭中剂量组龙生蛭高剂量组阿司匹林组10 10 10 10 10 TT（s）24.30±4.50 29.78±8.90 35.07±8.74*47.04±9.41**36.63±6.77*PT（s）13.63±0.92 15.03±1.26 21.82±6.63*32.04±7.51**15.92±4.01 APPT（s）27.50±6.27 33.74±3.49 37.92±8.60 53.81±10.28**30.63±5.38 FIB（g/L）42.49±10.98 57.30±22.49 61.63±8.14*90.04±30.47**66.09±14.32**

中医治疗心脑血管病的中药材都有活血化瘀、抗血栓形成、溶解血栓的作用，并有降脂抗凝、降低血小板聚集和黏附、改善血管内皮功能、解除心脑血管痉挛，增加心脑血供的功效［13］。中医治病求本，注重调整阴阳，重视患者体质的差异性，辨证施治。气虚可引起血液流变学异常，缺血性脑血管病血液流变性明显异常，临床研究也表明，气虚血瘀证患者表现为明显的血流变异常［14］，气虚无以推动血液，可能是血液流变性异常的原因之一，也是中医“气为血帅”“气虚致瘀”的理论依据。而益气活血法及方药能明显改善血液流变学指标［14］，以黄芪、水蛭为君药的龙生蛭胶囊，具有补气活血，逐瘀通络的功效，可强效活血，标本同治。临床研究也表明，龙生蛭胶囊用于治疗脑梗死恢复期、后遗症期、血管性痴呆等，中医辨证为气虚血瘀型的患者，取得了较好的临床疗效［15-18］。本实验通过血液流变学的观察角度，为临床中医药及中西医结合治疗缺血性中风提供中医配伍、药物联合应用等的实验依据。

本研究通过体外抗凝实验，表明龙生蛭胶囊主要通过激活纤溶酶原，进而活化纤溶酶，达到溶解纤维蛋白块的作用。龙生蛭胶囊能促进纤维蛋白块溶解，延长血浆复钙时间，能延长体外PT，具有较好的体外抗凝作用，减缓血栓的形成。通过正常小鼠体内抗凝和抗血栓实验，表明龙生蛭胶囊能明显延长TT、PT和APTT，明显提高血浆中FIB水平，使正常小鼠的凝血时间延长，具有较好的抗血栓和抗凝的功效，从而能够较好地抑制血栓的形成。龙生蛭胶囊以黄芪和水蛭为君药，还有红花、川芎、当归等10味中药。有研究表明黄芪和水蛭的提取物均具有抑制血栓形成的作用［19-21］。龙生蛭胶囊集多味活血化瘀中药为一体，在以往的研究中也被证实有抗脑缺血及脑缺血后的神经保护作用［22］。本研究通过多项指标的测量，其结果表明龙生蛭胶囊在体内外均具有抗凝、抗血栓作用，可为龙生蛭胶囊在临床中治疗脑缺血疾病提供可靠的实验依据。