探讨金银花、连翘防治新型冠状病毒肺炎的网络药理学机制※

张 艳,田晓玲,李思思,杨金月,华 川,2

(1.湖北中医药大学,湖北 武汉430061;2.湖北省中医院,湖北 武汉430074)

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19),简称新冠肺炎,临床表现为发热、咳嗽、气促、呼吸困难等,可并发严重的急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭,危重者可致死亡[1]。国家中医药管理局相继发布了COVID-19的中医药预防方案及临床诊疗方案,中医药积极参与疫情防控取得了满意的临床疗效[2]。蒋鹏飞等[2]分析全国各地区COVID-19中医药预防方案,发现金银花的使用频次最高,且四川省、湖南省、黑龙江省、浙江省、云南省、北京市等地区均有将金银花、连翘共同使用的预防方药。研究表明,清热解毒类中药具有抗病毒、解热、抗炎、调节免疫功能等作用,金银花、连翘提取物能直接通过抑制病毒蛋白的增殖表达而发挥抗病毒的作用[3]。《滇南本草》言金银花:“清热,解诸疮,痈疽发背,丹流瘰疬。”《神农本草经》言连翘:“主寒热,鼠瘘,瘰疬,痈肿恶疮,瘿瘤,结热。”研究表明,金银花含有黄酮类、有机酸类、挥发油类等成分,连翘化学成分包括苯乙醇苷类、木脂素类、萜类和黄酮类等,两药配伍具有抗病毒、抗菌、解热、抗炎等功效[4]。本研究基于中药网络药理学方法,通过构建“中药-靶点-疾病”互作网络,阐释金银花、连翘通过多成分、多靶点、多途径发挥清热解毒、疏散风热的作用机制,以期为临床治疗COVID-19提供参考。

1 资料与方法

1.1 筛选中药活性成分 利用中药系统药理学数据库与分析平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php,TCMSP)和中草药有效成分蛋白靶点数据库(http://lifecenter.biosino.org/hit/,HIT)检索金银花、连翘的化学成分,筛选口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18的活性成分。

1.2 预测药物候选靶点 检索TCMSP、药物数据库(https://www.drugbank.ca/,Drugbank),获取药物候选靶点信息。利用欧洲蛋白质信息资源数据库(https://uniprot.org,UniProt)的uniprot KB搜索功能,规范药物候选靶点的蛋白名称,设定筛选物种为“homo sapiens”。

1.3 疾病靶点 通过人类基因数据库(http://www.genecards.org/,GeneCards数据库)检索以“corona virus”“pneumonia”为关键词的 COVID-19靶点。利用uniprot KB搜索功能规范COVID-19靶点的蛋白名称,设定筛选物种为“homo sapiens”。

1.4 药物-疾病潜在靶点网络关系 取药物活性成分靶点与COVID-19靶点的交集,得到药物-疾病潜在靶点。将潜在靶点信息导入Cytoscape 3.7.2中绘制“药物-靶点-疾病”网络图。

1.5 蛋白互作网络构建及生物信息学分析 将药物候选靶点导入Metascape数据库(http://metascape.org/)进行蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)分析,设定物种为“homo sapiens”,将蛋白互作结果导入Cytoscape 3.7.2软件,并绘制PPI网络,分析网络拓扑参数,筛选关键蛋白靶点,并通过MCODE算法对PPI网络中的重要模块进行生物信息学分析。

2 结果

2.1 药物活性成分候选靶点及疾病相关靶点 利用TCMSP数据库检索出金银花活性成分23个、连翘活性成分23个,其中共有活性成分4个[β-谷甾醇(betasitosterol)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、槲皮素(quercetin)],两种药物去重后得到活性成分共42个,见表1。查阅相关文献补充金银花、连翘未满足筛选条件的活性成分4个,分别为绿原酸(chlorogenic acid)、连 翘 酯 苷 A/B(forsythialan A/B)、熊 果 酸(ursolic acid)、齐墩果酸(oleanolic acid)。上述46个活性成分共检索出518个活性成分靶点,去重后得到214个靶点。见表1。

2.2 药物-疾病潜在靶点 通过GeneCards数据库检索,获得与COVID-19相关的靶点基因1 150个。将金银花、连翘的作用靶点与COVID-19的靶点相映射,利用韦恩图(http://bioinfogp.cnb.es/tools/venny/,venny diagram)得到交集靶点(潜在靶点)59个。见图1(扫描标题处二维码,下同)。

2.3 “药物-靶点-疾病”网络构建 将金银花、连翘活性成分与药物-疾病潜在靶点信息导入Cytoscape 3.7.2,绘制“药物-靶点-疾病”可视化网络图。见图2。

表1 金银花、连翘主要活性成分信息

2.4 潜在靶点生物信息分析及PPI网络构建 ①用DAVID 11.0软件对59个潜在靶点进行GO功能分析,得到生物过程(biological process,BP)118条、分子功能(molecular function,MF)22条,细胞成分(cell composition,CC)26条。生物过程主要涉及脂多糖介导的信号通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)、氧化应激反应(response to hypoxia)、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter)、蛋白质寡聚化的正调控(positive regulation of protein oligomerization)、宿主共生体生长的负调控(negative regulation of growth of symbiont in host)等过程;分子功能主要参与细胞外机制(extracellular space)、线粒体(mitochondrion)、过氧化物酶体(peroxisome)等过程;细胞成分主要参与跨膜蛋白结合(identical protein binding)、丝氨酸型内肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)等过程。见图3。②应用DAVID 11.0数据库对潜在靶点进行通路分析,并结合相关文献得到100条相关的信号通路。主要涉及TNF信号通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Fox O 信号通路(Fox O signaling pathway)、T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)等病理通路,提示金银花、连翘活性成分可能通过抗炎、调节免疫、解热止痛、镇静等方面防治COVID-19。见图4。

2.5 潜在靶点的MCODE算法模块分析 采用Metascape中BioGrid数据库的PPI和MCODE算法模块分析功能,得到潜在靶点PPI网络及3个重要模块。网络中共有节点数59个,边730条,平均节点度24.760,平均局部聚类系数0.751。3个重要模块共16个靶点(模块1:AR、RB1、MAPK8、TP53、MAPK1、BCL2,模块 2:APP、PPARG、JUN、HSPA5、CDK4、MAPK14,模块3:EGF、GJA1、EGFR、INS)。见图5。

3 讨论

新型冠状病毒感染人体后存在一定潜伏期,当人体免疫力低下时,病毒入侵呼吸系统,引起一系列炎症反应,如咳嗽、咯痰、喘息等表现。新型冠状病毒属中医“戾气”范畴,其病位在肺,主要病机为湿、毒,治疗以解毒化湿贯穿始终。目前,新型冠状病毒的疫苗正在研发阶段,中医预防和治疗该病尤为重要[5]。清热类中药金银花、连翘是COVID-19防治的主要中药,但其作用机制尚未完全清楚。应用网络药理学从分子水平预测金银花、连翘治疗疾病的相关靶点和通路等,可为COVID-19研究提供参考。网络药理学通过“药物-靶点-疾病”多层次的网络构建[6],融合多学科的技术和内容,从整体角度探索中药与疾病的关联性,具有整体性、系统性的特点,得到越来越广泛的认可和应用。研究表明,发热是COVID-19重要的临床表现之一,其机制可能与IL(白介素)-1β、IL-6、TNF(肿瘤坏死因子)等内源性致热原相关[7]。TNF-α是细胞因子网络中的启动因子,能诱导其他细胞因子释放,如IL-6、IL-1β等,共同对组织造成损伤,其中IL-6是造成细胞因子风暴的典型促炎因子[8]。

本研究基于网络药理学方法预测金银花、连翘治疗COVID-19的作用机制,获得金银花、连翘活性成分46个,主要涉及黄酮类、木脂素类、挥发油类、苯乙醇苷类等,共有活性成分为β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、槲皮素。研究表明,黄酮类化合物,尤其是槲皮素,具有广泛的活性,具有抗氧化、降血糖、抑制肿瘤等,可应用于治疗各种炎症[9]。木犀草素抗病毒活性体现在对抗登革热病毒,限制其病毒体的成熟过程,降低毒血症的发生[10]。金银花的石油醚、丙酮、乙醇、水提取物均具有抑制流感病毒的作用[11]。连翘脂素可干预TNF-α、IL-6等通路,发挥抗炎抑制作用[12]。连翘富含的木脂素类、苯乙醇苷类及黄酮类等也具有抗炎活性[13]。

金银花、连翘有效活性成分对应的药物候选靶点与COVID-19疾病相关靶点映射得到59个潜在靶点。通过进一步的PPI网络构建与重要模块子网络提取,共获得16个靶点(AR、RB1、MAPK8、TP53、MAPK1、BCL2、APP、PPARG、JUN、HSPA5、CDK4、MAPK14、EGF、GJA1、EGFR、INS)。新型冠状病毒经过呼吸道侵犯肺部,容易引发肺部缺氧和炎症反应。研究发现,过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)与炎症关系密切,可通过促炎基因涉及的反转录机制直接转录下调影响炎症反应[14]。EGF、EGFR等表皮生长因子参与细胞增殖,可在VCAM1的黏附作用下促进内皮屏障的重建,改善急性肺损伤[15]。

潜在靶点通路主要涉及TNF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、Fox O信号通路、T细胞受体信号通路等。研究表明,TNF信号通路中的TNF-α在炎症反应早期可大量释放,诱导IL-1、IL-6等促炎因子的产生[16]。PI3K/Akt信号通路参与氧化应激、自噬、炎症等多种病理活动,影响IL-1β、IL-6及TNF-α等炎症因子表达[17]。HIF-1信号通路可多途径调控VEGF、TGF-β1等靶基因的表达,改善气道炎症及气道重塑,缓解咳嗽、咯痰、喘息等症状[18]。

综上所述,在本研究构建的“药物-靶点-疾病”网络中,金银花、连翘通过槲皮素、木犀草素、苯乙醇苷等多种活性成分,作用于TNF信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路等发挥抗炎、调节免疫、解热止痛、镇静等作用。但鉴于网络药理学的局限性,后续还需加强实验设计,并进行实验证实。