基于有效基准特征图谱质量表征的丁香质量评价研究

武秋红 孔静 黄玉娟 范圆圆 李思潼 刘路路 高园园 陈思玉 孙仁弟 黄广伟 姜艳艳 石任兵

丁香，始载于《药性本草》，是桃金娘科植物丁香EugeniacaryophyllataThunb.的干燥花蕾，属于“药食同源物品”之一，其性温，味辛，归脾、胃、肾经，具有温中止痛、降逆的作用，用于治疗脾胃虚寒、呃逆呕吐、食少吐泻、心腹冷痛和肾虚阳痿[1]。

文献表明，丁香主要含有黄酮类、苯丙素类、酚酸类、三萜类等化学成分[2]。有文献分别报道对丁香中的苯丙素类成分丁香酚，黄酮类成分芦丁、槲皮素，三萜类成分齐墩果酸、熊果酸、山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸进行含量进行测定[3-5]，对酚类成分丁香酚、阿魏酸、槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量测定及指纹图谱研究[6]；2015年版《中华人民共和国药典》以丁香酚的含量作为丁香饮片质量标准指标[7]。

笔者在对理气类药食同源药味质量表征研究中，发现丁香具有确切的促胃动力功效作用(左旋精氨酸所致大鼠胃动力障碍模型下，大鼠胃残留率、血浆胃动素，给药组与模型组比较P<0.01)。本文报道在本课题组前期建立的中药质量评价模式基础上[8-16]，进一步研究建立有效基准特征图谱质量表征模式、方法与质量评价。即以确定有促胃动力作用的丁香饮片作为饮片基准，以具有促胃动力功效的代表性成分及其含量作为质量表征基准点，采用HPLC-PDA(高效液相色谱-二极管阵列检测器；High Performance Liquid Chromatography-Photo-diode Array)建立丁香有效基准特征图谱，涵盖其提取物促胃动力药物体系之药学架构主要化学类型：酚酸类、黄酮类、苯丙素类、三萜类；基于对照品模拟基准点的有效基准特征图谱质量表征信息作为评价丁香饮片的质量标尺，并对其准确性进行佐证及质量评价应用与验证。以精准、有效、简易地评价丁香饮片的质量，为丁香的应用提供科学依据，也为有关药物的质量有效评价与控制提供借鉴。

1 材料

1.1 仪器

Waters e2695自动进样高效液相色谱仪，2998PDA检测器，Empower工作站；XS205型1/100000电子分析天平和AL204型1/10000电子分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；DK-98-1型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；Serial型数控超声波清洗器(北京市超声仪器有限公司)。

1.2 试药与试剂

没食子酸对照品(批号：110831-201204，纯度≥98%)、异槲皮苷对照品(批号：P25J9F65872，纯度≥98%)、丁香酚对照品(批号：Z03D5Y7，纯度≥98%)、山楂酸对照品(批号：Z24F9B54635，纯度≥98%)、齐墩果酸对照品(批号：HA0820KA14，纯度≥98%)均购自上海源叶生物科技有限公司；色谱级乙腈，购自Fisher Scientific公司；纯净水，购自杭州娃哈哈集团有限公司；分析甲醇。从各药店购得的15批丁香饮片，其中S10为前期药效实验中确定有促胃动力作用的丁香饮片(饮片基准)，由北京中医药大学鉴定系刘春生教授鉴定，所购丁香饮片都是正品饮片，丁香饮片的采购地点、产地、批号见表1，留样饮片存储于北京中医药大学良乡校区中药化学系。

表1 15批丁香饮片的产地、批号及采购地点

2 方法与结果

2.1 有效基准特征图谱质量表征方法的建立

2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品3.93 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得没食子酸对照品溶液(a)；精密称取异槲皮苷对照品2.95 mg，置20 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得异槲皮苷对照品溶液(b)；精密称取丁香酚对照品21.67 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得丁香酚对照品溶液(c)；精密称取山楂酸对照品3.91 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得山楂酸对照品溶液(d)；精密称取齐墩果酸对照品5.92 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得齐墩果酸对照品溶液(e)；分别精密量取a、b、c、d、e对照品溶液各1.0 mL、0.5 mL、5.0 mL、1.0 mL、1.0 mL置同一10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得含没食子酸、异槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齐墩果酸浓度分别为：39.300 μg/mL、7.375 μg/mL、1.0835 mg/mL、39.100 μg/mL、59.200 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取过二号筛的丁香饮片基准(S10)粉末及待评价饮片粉末约0.25 g，精密称定，置于100 mL具塞的锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定其重量，加热回流提取2次，每次1小时，冷却至室温，再称定其重量，用80%甲醇补足失重，摇匀，滤过，用少量80%甲醇分次洗涤容器和残渣，滤过，将滤液与洗涤液合并于100 mL圆底烧瓶中，50℃减压浓缩，并完全转移至25 mL棕色容量瓶，冷却至室温，80%甲醇定容至刻度线，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 色谱检测条件 XBridge Shield RP18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：乙腈-2%磷酸水溶液，梯度洗脱(0～10分钟，5%～6%A；10～30分钟，6%～22%A；30～50分钟，22%～23%A；50～70分钟，23%～47%A；70～75分钟，47%～75%A；75～100分钟，75%A)，流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长：215 nm，进样量20 μL，采集时间：100分钟。

丁香饮片(S10)样品、混合对照品在以上色谱检测条件下的HPLC色谱图，见图1。

14个色谱峰在图谱中显示分离度良好，通过与没食子酸、异槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齐墩果酸对照品紫外吸收光谱对比，判断14个特征峰对应的化学成分类型，涵盖了丁香酚酸类、黄酮类、苯丙素类、三萜类4种主要化学成分类型。

注：A供试品；B混合对照品；1没食子酸；2异槲皮苷；3丁香酚；4山楂酸；5齐墩果酸；6、7酚酸类成分；8、9、10、11、12、13黄酮类成分；14苯丙素类成分。

2.1.4 有效基准特征图谱方法学考察 (1)精密度考察：按2.1.2项下制备丁香饮片(S10)供试品溶液，按2.1.3项下色谱检测条件，连续进样6次测定，以丁香酚为参照，计算各色谱峰与参比峰的相对峰面积和相对保留时间，结果显示：相对峰面积的RSD均小于1.32%，相对保留时间的RSD均小于1.26%，表明仪器精密度良好，符合特征图谱要求(RSD≤3%)[17]。(2)稳定性考察：按2.1.2项下制备丁香饮片(S10)供试品溶液，室温放置，于制备后0、2、4、6、8、12、24小时，按2.1.3项下色谱检测条件分别进样测定，以丁香酚为参照，计算各色谱峰与参比峰的相对峰面积和相对保留时间，结果显示：相对峰面积的RSD均小于1.42%，相对保留时间的RSD均小于1.56%，表明供试品溶液在24小时内基本稳定(RSD≤3%)[17]。(3)重复性考察：取丁香饮片(S10)，按2.1.2项下方法平行制备丁香饮片(S10)供试品溶液6份，按2.1.3项下色谱检测条件分别进样测定，以丁香酚为参照，计算各色谱峰与参比峰的相对峰面积和相对保留时间，结果显示：相对峰面积的RSD均小于2.12%，相对保留时间的RSD均小于1.82%，表明本方法重复性良好(RSD≤3%)[17]。

2.1.5 代表性成分含量测定方法学考察 (1)线性关系考察：按2.1.1项下制备混合对照品溶液，按2.1.3项下色谱检测条件分别进样2、 5、 10、 15、 20、 25、 30 μL，测定代表性成分峰面积，以对照品的量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，线性方程相关系数r均大于0.99，表明线性范围符合测定要求(r≥0.99)[17]。见表2。(2)精密度考察：按2.1.2项下制备丁香饮片(S10)供试品溶液，按2.1.3项下色谱检测条件，连续进样6次测定，计算没食子酸、异槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齐墩果酸峰面积的RSD均小于2.63%，表明仪器精密度良好，符合含量测定要求(RSD≤3%)[17]。(3)稳定性考察：按2.1.2项下制备丁香饮片(S10)供试品溶液，室温放置，于制备后0、2、4、6、8、12、24小时，按2.1.3项下色谱检测条件分别进样测定，计算没食子酸、异槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齐墩果酸峰面积的RSD均小于2.25%，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好(RSD≤3%)[17]。(4)重复性考察：取丁香饮片(S10)，按2.1.2项下方法平行制备丁香饮片(S10)供试品溶液6份，按2.1.3项下色谱检测条件分别进样测定，结果表明本饮片样品中没食子酸、异槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齐墩果酸的平均含量分别为0.4175%、0.0610%、15.7583%、0.3186%、0.5795%，RSD分别为1.21%、2.88%、1.46%、2.28%、1.90%，表明本方法重复性良好(RSD≤3%)[17]。(5)加样回收率考察：精密称取没食子酸对照品5.21 mg、丁香酚对照品196.86 mg、山楂酸对照品4.83 mg、齐墩果酸对照品7.30 mg置同一10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(f)；精密称取异槲皮苷对照品2.84 mg置20 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得异槲皮苷对照品溶液；取已知特征代表性成分含量的过二号筛的丁香饮片(S10)粉末6份，约0.125 g，精密称定，分别置于6个100 mL具塞锥形瓶中，同时精密量取混合对照品溶液(f)1.0 mL、异槲皮苷对照品溶液0.5 mL置以上6个100 mL具塞锥形瓶中，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算没食子酸、异槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齐墩果酸的平均加样回收率分别为100.33%、97.90%、100.12%、96.89%、101.45%，RSD分别为2.20%、1.92%、1.84%、2.82%、1.83%，表明本方法准确可靠(回收率在95%～102%之间，RSD≤3%)[17]。见表3。

2.1.6 模拟基准点质量表征考察 文献报道丁香酚具有促胃动力作用[1]，因此以丁香酚作为质量表征基准点。精密称取丁香酚对照品7.87 mg，至5 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.574 mg/mL的丁香酚对照品溶液作为模拟基准点，与2.1.2项下制备的丁香饮片(S10)供试品溶液中所检测的丁香酚含量相同，按2.1.3项下色谱检测条件进样测定，得模拟基准点的HPLC色谱图，见图2。

表3 加样回收率考察结果(n=6)

续表

由模拟基准点色谱图可得丁香酚对照品的保留时间及峰面积与丁香有效基准特征图谱中丁香酚的保留时间及峰面积相吻合，表明所建立的检测方法及其检测结果与模拟丁香质量表征基准点具有准确性，即丁香酚对照品溶液(1.574 mg/mL)可作为模拟表征点。

2.2 有效基准特征图谱质量表征信息

有效基准特征图谱中14个特征峰的保留时间、峰面积(以100 mg丁香饮片计)、含量，以模拟基准点为基准得到的相对保留时间、相对峰面积、相对含量，换算系数(代表性成分的相对含量/代表性成分的相对峰面积)，见表4。

表4 14个特征峰的保留时间、峰面积、含量、相对保留时间、相对峰面积、相对含量、换算系数

以上可得，基于模拟基准点得到的14个特征峰及其相对保留时间、相对峰面积，5个代表性成分的相对含量，即为丁香有效质量基准标尺。

2.3 评价与验证

取14批待评价丁香饮片，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.3项下色谱检测条件进样检测，得到的14批待评价丁香饮片质量表征信息，同时实测丁香饮片S10(基准)有效基准特征图谱，以及实测14批待评价丁香饮片代表性成分含量，以验证基于质量标尺进行丁香质量评价的准确性。如图3、4、5、6，以及表5所示。

如图3、4所示，14批丁香饮片特征图谱皆含有14个相同的特征峰，且14个特征峰相对保留时间与基准标尺基本一致，同时也与实测值相吻合。结果表明：14批皆为丁香饮片，且验证了应用基准标尺辨别丁香饮片真伪的准确性。

图3 14批丁香饮片与基准(S10)的HPLC特征图谱(215 nm)

图4 14批丁香饮片与基准(S10)相对保留时间

由图5、6可见14批丁香饮片质量表征信息，根据其特征峰相对峰面积及其相对含量高于其基准标尺对应点的数目、幅度和所涵盖的4种主要化学类型及其丁香酚同类成分，综合考量评价得出样品S13、S2、S9、S14、S15、S3和S7质量较优。

图5 14批丁香饮片与基准(S10)的相对峰面积

图6 14批丁香饮片与基准(S10)的相对含量

由表5可得，换算含量与实测含量基本一致，即验证了代表性成分换算含量结果的准确性及其相对含量结果的准确性。

表5 14批丁香饮片中5个特征代表性成分的含量(%；n=2)

3 讨论

本研究在自然药学观相关理论的指导下[18-21]，建立了丁香有效基准特征图谱质量表征方法，丁香饮片中的14个特征峰覆盖了苯丙素类、黄酮类、酚酸类、三萜类这四种化学成分类型，其中，丁香酚具有健脾胃的作用[1]、没食子酸具有抗消化性溃疡的作用[22]、齐墩果酸具有抗胃溃疡的作用[23]、异槲皮苷具有对人胃癌细胞SGC-7901增殖抑制及诱导凋亡作用[24]，苯丙素类成分具有健胃的作用[1]，黄酮类、酚酸类、三萜类成分均对消化系统有积极作用[25-26]，从而整体反映了丁香的有效物质基础。同时构建了丁香质量评价模式，并对14批丁香饮片进行了饮片质量优良度评价，经构建的丁香质量评价模式分析可知：样品S13、S2、S9、S14、S15、S3和S7质量较优。建立的丁香基准有效特征图谱质量表征模式、方法能够整体、准确、简易地对丁香饮片进行质量表征，构建的丁香质量评价模式关注了丁香饮片质量的精确性与应用有效性，为丁香的质量评价与筛选及其药物质量的精准预期提供了依据。