基因芯片法在结核分枝杆菌耐药基因快速诊断中的应用价值

杨映晖 伍定辉 苏伟明 董春萍 姚向阳

随着对结核分枝杆菌耐药分子机制研究的深入，多种结核分枝杆菌耐药基因的检测方法相继出现。基因芯片法是近年来在医疗领域最具影响力的科技发展成果之一，可快速检测临床疑似标本中的分枝杆菌属DNA。本研究采用前瞻性的方法，通过对患者同一份痰标本同时进行基因芯片法、GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)和BACTEC MGIT 960液体培养及其比例法药物敏感性试验(简称“MGIT 960培养及其比例法药敏试验”)3种方法进行结核分枝杆菌及其耐药基因rpoB、katG及inhA的检测，并对3种检验结果进行对比分析，探讨基因芯片检测技术的优势和不足。

资料和方法

一、资料收集

采用前瞻性的方法，收集2017年6月至2018年6月厦门大学附属第一医院肺科门诊及住院的疑似肺结核患者的痰标本。标本采用患者晨痰，同一份痰标本同时进行基因芯片法、GeneXpert法和MGIT 960培养及其比例法药敏试验3种方法进行检测。肺结核诊断标准参照《WS 288—2017 肺结核诊断》[1]。本研究收集933例患者的晨痰标本；其中，男674例，女259例；年龄11～84岁，中位年龄56岁。

二、仪器与试剂

分枝杆菌菌种鉴定芯片(成都博奥晶芯生物科技有限公司；产品货号301030)；结核分枝杆菌耐药基因检测芯片(成都博奥晶芯生物科技有限公司；产品货号301035)；Extractor 36核酸快速提取仪(博奥生物集团有限公司)；LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪及配套仪器(博奥生物集团有限公司)；GeneXpert MTB/RIF检测仪(美国Cepheid 公司)；结核分枝杆菌rpoB基因和突变检测试剂盒(Cepheid AB 瑞典赛沛公司；产品货号1000061494)；BACTEC MGIT 960全自动培养仪(美国BD公司)；分枝杆菌药物敏感性罗氏培养基(珠海贝索生物技术有限公司)。

三、菌种及耐药基因检测

(一)基因芯片法检测

1.标本制备及核酸提取：痰标本加入等量10% NaOH溶液，振荡液化15～20 min，以3035×g离心5 min，离心后弃上清。再加入1 ml生理盐水，充分振荡后以12 830×g离心5 min，离心后弃上清。向核酸提取管中加入80 μl核酸提取液，加入上述标本后，使用Extractor 36核酸快速提取仪振荡5 min，95 ℃水浴5 min，再以8910×g离心1 min。

2.PCR扩增：采用不对称扩增法对相关基因位点进行扩增。分别采用PCR扩增试剂1、2、3对每份样品进行3管PCR扩增反应。分别向3管中加入2 μl模板DNA和18 μl PCR扩增试剂。每管PCR反应体系总体积为20 μl，置于PCR扩增仪中进行扩增。PCR反应条件为：37 ℃激活10 min；94 ℃变性600 s；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35个循环；94 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，10个循环；72 ℃ 420 s。

3.芯片杂交与结果判读：扩增反应完成后，在利福平芯片杂交管中加入3 μl扩增产物1、3 μl扩增产物2和9 μl杂交缓冲液，在异烟肼芯片杂交管加入3 μl扩增产物1、3 μl扩增产物3和9 μl杂交缓冲液。15 μl杂交反应混合物于95 ℃变性5 min，后立即冰水浴3 min。吸出13.5 μl杂交反应混合物加入芯片阵列，再置于50 ℃杂交仪中杂交120 min。杂交后经洗涤甩干后使用LuxScan10K-B微阵列芯片扫描仪和晶芯软件进行信号的读取及结果的判读。

(二)MGIT 960培养及其药敏试验

取4倍体积的4% NaOH溶液溶于痰标本中，旋涡振荡混匀，使痰标本充分液化，静置15 min，以3035×g离心5 min，弃上清后中和，用一次性无菌吸管吸取处理后的痰标本0.5 ml，接种于液体培养管中，加载到BACTEC MGIT 960全自动培养仪上。培养阳性后，通过萋尼抗酸染色确定是否培养出抗酸杆菌；取阳性菌株接种于罗氏培养基进行传代，并接种噻吩-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸鉴别培养基，鉴定是否为结核分枝杆菌。比例法药敏试验：挑取对数生长期的结核分枝杆菌菌落，用灭菌生理盐水配制1麦氏浊度的菌悬液，然后使用无菌的10 μl标准接种环，进行100倍和10 000倍稀释，用10 μl无菌标准接种环分别挑取10 000倍稀释菌悬液一环，划线接种于一组空白对照培养基和含药培养基，再用10 μl无菌标准接种环分别挑取100倍稀释菌悬液一环，划线接种于另外一组空白对照培养基和含药培养基，拧紧培养基管盖，竖直置于恒温培养箱中，于37 ℃培养4周后观察记录药敏试验结果。

(三)GeneXpert检测

将痰标本与消化液以1∶2的比例加入15 ml无菌干燥离心管中，振荡，室温静置15 min，使痰标本充分液化。使用与GeneXpert MTB/RIF样品盒配套的一次性移液管，将2 ml处理后的样品加至样品盒中，将样品盒扫描二维码，录入信息，放入GeneXpert MTB/RIF仪器中，2 h后读取记录检测结果。

四、质量控制

所有参加本研究的工作人员均接受严格、系统的培训并掌握实施方案，严格按照标准纳入患者，完成各项操作，进行结果判断。实验过程均做阴性、阳性质量控制。

五、统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计数资料以“率(%)”描述，采用χ2检验进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。一致性检验采用Kappa检验，Kappa值≥0.75为两者一致性较好，0.4≤Kappa值<0.75为两者一致性一般，Kappa值<0.4为两者一致性较差。各百分率的95%CI采用OpenEpi 3.01软件进行计算。

结 果

一、基因芯片法检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药的效能

933例患者的痰标本中，基因芯片法检测出阳性484例，GeneXpert检测出阳性462例，MGIT 960培养出阳性411例。3种检测方法均为阳性的标本有395例，从3种检测结果均为阳性的标本中通过Excel表以完全随机的方式抽取232份分别进行异烟肼耐药基因katG及inhA检测。以MGIT 960培养及其药敏试验结果为参考标准，基因芯片法检测出异烟肼耐药的敏感度为86.67%(26/30)，特异度为96.53%(195/202)，一致性达95.26%(221/232)，Kappa值为0.798(0.682～0.914)，具有良好的一致性(表1)。

二、基因芯片法和GeneXpert检测结核分枝杆菌对利福平耐药的效能

分别采用基因芯片法和GeneXpert进行利福平耐药基因rpoB检测，同样以MGIT 960培养及其药敏试验结果为参考标准，基因芯片法检测出的利福平耐药敏感度为93.75%(30/32)，特异度为97.00%(194/200)，一致性达96.55%(224/232)，Kappa值为0.862(0.768～0.956)，两者具有良好的一致性(表2)。

以MGIT 960培养及其药敏试验结果为参考标准，GeneXpert检测出的利福平耐药敏感度为84.38%(27/32)，特异度为97.00%(194/200)，一致性达95.26%(221/232)，Kappa值为0.803(0.691～0.915)，两者具有良好的一致性(表2)。

表1 以MGIT 960培养及其药敏试验结果为参考标准判断基因芯片法检测异烟肼耐药性的效能

表2 以MGIT 960培养及其药敏试验结果为参考标准判断基因芯片法与GeneXpert检测利福平耐药性的效能

表3 以MGIT 960培养及其药敏试验结果为参考标准判断基因芯片法与GeneXpert检测利福平耐药一致性的比较

将基因芯片法与GeneXpert进行比较，结果显示两种方法检测出的利福平耐药阳性一致性为90.91%(30/33)，阴性一致性为96.98%(193/199)，总一致性达96.12%(223/232)，Kappa值为0.847(0.749～0.945)，具有良好的一致性(表3)。

讨 论

耐药结核病是重大的公共卫生问题，为控制结核病的一大障碍[2]。尽早掌握结核分枝杆菌耐药状况及影响因素，可提高耐药结核病的发现和治疗能力[3]，对减少耐多药结核病的传播具有重大意义[4]。因此，临床实验室迫切需要开发特异度和敏感度高、检测速度快的检测方法。

目前，最普遍使用并被视为诊断结核病参考标准的MGIT 960培养及其药敏试验，存在操作繁琐、阳性率低、耗费时间长和生物安全性差等问题，明显滞后于结核病早期诊断的期望[5]，无法满足临床快速诊断的需求。近几年，随着分子生物学和基因工程技术的发展，分子诊断技术成为结核病快速诊断的主要手段[6]。其中基因芯片技术敏感、准确且简便可靠，可以同时检测到多种靶基因，如异烟肼耐药基因katG和inhA基因启动子及利福平耐药基因rpoB等常见突变位点。该检测手段所需样本量少、准确、信噪比极小且易于操作，开辟了新的临床诊断视野。

本研究将基因芯片法与GeneXpert和MGIT 960培养及其药敏试验进行了深入比较，在结核分枝杆菌快速检测及结核分枝杆菌耐药检测方面具有良好的敏感度和特异度。基因芯片法结果与传统细菌学培养和药敏试验结果具有良好的一致性，并且弥补了后者耗时长、阳性率低、占用实验室空间的缺陷；与GeneXpert方法比较，两种方法检测结果差异无统计学意义，但GeneXpert只能检测一种耐药基因(rpoB)，基因芯片技术能一次检测katG、inhA和rpoB3种耐药基因，对耐多药结核病的快速诊疗更有应用价值。代小伟等[7]、许榕青等[8]和王小路等[9]的研究结果也均显示基因芯片技术在结核分枝杆菌及耐药基因检测中具有明显优势，与本研究所获得的结果基本一致。

但是，每种方法都有各自的局限性，与其设计原理、操作复杂性及结果判读偏倚等有关。本研究发现，基因芯片法和GeneXpert在结核分枝杆菌检测的阳性例数方面，与MGIT 960培养及其药敏试验方法存在部分差异。分析可能的原因是：结核分枝杆菌的检出结果受多种因素限制，如细菌代谢及繁殖是否旺盛，是否处于休眠状态，是否存在形态多样性等因素[10]。结核分枝杆菌处于休眠或者衰亡状态，就可能出现培养阴性的情况。同时也突显出当今分子诊断技术普遍存在的不足之处，即不能判断结核分枝杆菌是否是具备传染性的活菌，不能准确评价所用药品的疗效。所以基因芯片法不能完全取代MGIT 960培养及其药敏试验方法，两者可以互相补充。

综上所述，基因芯片法在结核分枝杆菌及耐药基因的检测中，具有较高的敏感度和特异度，且检测时间短，与传统方法相比，具有快速、安全、准确、有效的特点，有利于耐多药结核病的早期诊断及防控，值得在临床诊疗中推广应用。