三种布鲁氏菌血清抗体检测方法在临床应用及评价

杨兴坤段建华寇俊峰焦耿军

（解放军联勤保障部队第940医院安宁医疗区1，甘肃 兰州，730070）

（甘肃省武威市凉州区中西医结合医院2，甘肃 兰州，733000）

布鲁氏菌病病是一种由布鲁氏菌引起的以动物和人为传染源的细菌性传染疾病，其主要特点是人畜共患[1].布鲁氏菌不仅感染感染途径多样而且临床表现复杂多变，症状不同，轻重各异，给临床诊断带来一定的难度，容易误诊。因此实验室诊断尤为重要。为客观评价三种布鲁氏菌血清检测方法的检出效果，选择本院936例血清标本和自制50人份血清盘同时使用虎红玻片凝集试验（RBPT）、试管凝集试验（SAT）、人布鲁氏菌抗体胶体金法（GICA）检测，通过实验结果分析，对比其阳性率，灵敏度，特异性，同时对检测方法的优缺点进行分析。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2019年1-7月期间我院门诊就诊患者936例血清标本，同时用RBPT，SAT，GICA三种方法检测，利用中国疾控中心布鲁氏菌阴性、阳性质控血清自制50人份血清盘，分别是30人份阳性血清标本，20人份阴性血清标本标本。

1.2 器材与试剂 仪器：赛默飞-B2生物安全柜，可调式恒温保温箱，可调速多用振荡器，微量移液器（量程：1-50ul，10-200uL，00-1000ul，Electron Finnpipette）计时器。耗材：一次性载玻片（2×4cm)，一次性玻璃试管（0.5×5cm)。试剂：布鲁氏菌虎红玻片凝集抗原、布鲁氏菌试管凝集抗原由辽宁吉浩生物科技有限公司生产，人布鲁氏菌IgG抗体检测试剂盒（胶体金法）由中新生物科技有限公司生产，布鲁氏菌阴性、阳性质控血清，500ml无菌生理盐水。

1.3 方法 RBPT采用玻片凝集法：在室温环境下，先取洁净载玻片一张，然后吸取待检标本血清30 ul，再吸取虎红凝集抗原30 ul充分混匀后，静置五分钟后观察其凝集程度，具体参照参照 WS 269—2019《布鲁氏菌病诊断标准》进行检测和结果判定[2]。SAT采用试管凝集法：在室温条件下，每份血清用 5支试管，第1管加入2.3ml生理盐水，第2管不加，第3、4、5管各加入0.5ml。用移液器吸取待检血清200ul，加入第1只试管中混匀。混匀后，以吸管吸取第1管中血清加入第2和第3管各 0.5 mL，以吸管将第三管混匀，并吸 0.5 mL加入第4管，混匀。从第4管吸取 0.5 mL加入第5管，混匀。再从第5管吸取 0.5 mL弃去。如此稀释后，从第2管到第5管血清稀释度分别为 1：12.5、1：25、1：50 和 1：100。加入抗原。先以生理盐水将抗原原液作适当稀释成抗原应用液（按照说明书操作，一般作 1：10稀释），稀释后的抗原应用液加入各稀释的血清管（第1管不加，作为血清对照），每管加 0.5 mL，混匀。加入抗原应用液后第作者：INSTR-ADMIN二管至第五管，每管总量 1 mL，血清稀释度从第二管到第五管分别为 1：25、1：50、1：100和 1：200。从第一管再吸出 0.5 mL弃去，剩 1 mL，每次实验设立阴阳性对照。阴性血清对照，血清稀释后加抗原应用液（与待检血清对照相似）；阳性血清对照，其血清稀释到原有滴度再加抗原应用液；抗原对照，适当稀释的抗原加生理盐水0.5 ml分别加入第 2至第 6管。则第 1管为抗体是否自凝对照，第 2至第 6管抗体稀释倍数分别是 1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。在振荡器上混匀 5 min后，37℃孵育 20 h～ 22 h，再室温放置 1 h～ 2 h，同时按相同方法作已知布病抗体阴、阳性血清对照试验。结果判断 方法：将试管与预先配制的“标准比浊管”对比，目测上部液体完全透明、管底呈明显倒伞状沉淀为 100%凝集：++++。上部液体近于完全透明、管底呈倒伞状沉淀为 75%凝集：+++。上部液体略微透明、管底呈较薄伞状沉淀为 50%凝集：++。上部液体稍微透明、管底呈不很明显伞状沉淀为 25%凝集：+。上部液体混浊不透明、管底无伞状沉淀，而是圆点或圆 盘状沉淀，为不凝集：－。对“－”性结果需再孵育 24 h，按上述标准判定结果。胶体金法：实验严格按试剂说明书操作。结果判定：阳性为质控线（C)和检测线(T)同时出现两条红色条带。阴性为只在质控线（C)位置出现一条红色带。无效为质控线（C)和检测线(T)均未出现红色条带。

1.4 统计学分析 实验数据通过SPSS16.0软件加以处理，数据用（%）表示，行X2检验，若P值＜0.05则表明差异明显，有统计学意义。

2 结果

2.1 RBPT、SAT、GICA检测结果分析 对936人份血清标本分别用三种方法平行检测结果详见下表1。

表1 RBPT、SAT、GICA检测结果分析

2.2 RBPT、SAT两种方法价检测结果分析 对 936人份血清分别用RBRT与SAT两种方法价检测结果对比见表2。

表2 RBPT、SAT两种方法价检测结果分析

2.3 RBRT与GICA两种方法检测结果分析 对 936人份血清分别用RBRT与GICA两种方法价检测结果对比见表3。

表3 RBRT与GICA两种方法检测结果分析

2.4 RBRT与GICA两种方法检测结果分析 对 936人份血清SAT与GICA两种方法价检测结果对比见表4。

表4 RBRT与GICA两种方法检测结果分析

2.5 三种检测试剂盒的性能结果 三种布鲁氏菌抗体检测试剂盒的性能见表5。

表5 三种检测试剂盒的性能结果

3 讨论

布鲁氏菌病的实验室诊断方法有：细菌分离培养、虎红玻片凝集试验（RBPT）、试管凝集试验（SAT)、补体结合试验（CFT)、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金标试验（GICA），抗人免疫球蛋白试验（Coomb`s）、聚合酶链式反应（PCR）等，细菌分离培养技术是最传统的布鲁氏菌病细菌学诊断方法，也是诊断布鲁氏菌病的“金标准”[3]，但是临床上细菌培养的阳性率不高，因此临床上诊断布鲁氏菌病常用的方法主要有PBRT、SAT、CFT、ELSIA、GICA.RBPT是临床初步筛查布病的常用检测方法之一，因其在临床检验中检测成本低，敏感性强，操作简单[4]，反应快，耗时短，适合应用于布鲁氏菌病的大规模初筛检验，但缺点是PBRT以布氏杆菌细胞壁的脂多糖上的O-链抗原作为诊断靶点[5]，且布氏杆菌与小肠耶尔森O9、大肠杆菌O157、沙门氏菌具有高度的类似O抗原，易出现交叉反应，导致结果出现假阳性；另一个缺点为RBPT易受到外界因素的影响（温度、凝集时间、光线等)，或者受采血及检测人员水平的限制造成假阴性结果[6]。SAT是属国内法定诊断布病的确诊方法，优点为特异性、准确性高于PBPT；但缺点为与PBRT、GICA相比而言操作相对复杂，耗时长，通常须在恒温箱放置20-22小时后，置室温1-2小时观察结果，且由于血清中存在不完全抗体竞争抗原而造成抗原抗体比例失调而造成前带现象[7]，造成结果假阴性。GICA采用胶体金免疫层析技术原理，在硝酸纤维素膜上的检测线包被重组布鲁氏菌抗原，在质控线包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗体，在金标垫上包被胶体金标记的小鼠抗人IgG多克隆抗体。当检测阳性样本时，阳性血清中的布鲁氏菌IgG抗体可与胶体金标记的人鼠抗人IgG抗体结合，形成免疫复合物，由于层析作用复合物与样本在硝酸纤维素膜内向前流动。当复合物经过检测时与宝贝的重组布鲁氏菌抗原结合，形成“Au-小鼠抗人IgG单克隆抗体-布鲁氏菌IgG抗体-布鲁氏菌抗原而凝集显色。其优点为操作简单，耗时少，结果易判定，且灵敏度高，缺点为特异性差，易受到血样、温度、湿度的影响易出现假阴性结果。

三种布鲁氏菌血清抗体检测方法检测结果数据分析：RBPT、SAT、GICA 三种检测方法的阳性率分别为27.62%，19.19%，28.34%，RBPT法与GICA法相比，两种方法阳性率高，灵敏度高，适合布病初筛。RBPT法与SAT法比较（P值＜0.05），SAT法特异性高GICA法与SAT法相比较（P值＜0.05），GICA法灵敏性高。

综上所述，RBPT、GICA适用于大样本量的检验，以及布鲁氏菌病的初筛，SAT适用于小样本量的检验，用于布鲁氏菌病的确诊.三种方法各有优缺点，在临床实验室诊断中应该采用RBPT、SAT或GICA、SAT联合检测。