蜂蜜中α-淀粉酶活力测定方法改进

陈雪洋　田珂雪

摘要：用分光光度法测定蜂蜜可溶性淀粉溶液真空冷冻干燥后α-淀粉酶值的稳定性，并在扫描电镜下观察，与原可溶性淀粉颗粒进行形貌特征比较。用统计学方法对该测定方法验证表明，真空冷冻干燥的淀粉可以对蜂蜜α-淀粉酶进行测定，结果稳定性好，为制作蜂蜜快速检测试剂盒提供了理论基础。

关键词：蜂蜜;冷冻干燥;α-淀粉酶活力;测定方法改进

蜂蜜是我们生活中常见的天然营养佳品，含有与人体血清浓度相近的多种无机盐、维生素及铁、钙、铜、锰等等多种有益人体健康的微量元素，具有滋养、润燥、解毒、美白养颜、润肠通便等功效，对少年儿童咳嗽有一定治疗效果，还有抗菌、改善新陈代谢、增强体质、提高人体免疫力、抑制肿瘤等药理作用。一些被利益驱使的商人通过在蜂蜜中加入葡萄糖、果糖、高果玉米糖浆等价格低廉的甜味物质来提高蜂蜜的产量。目前也有许多种鉴别蜂蜜的方法，但是都有一定缺陷。真蜂蜜具有花蜜和蜜蜂的某些特殊成分，掺假蜂蜜的这些特殊成分含量则降低。本文选择其中的α-淀粉酶作为研究对象，测定蜂蜜中α-淀粉酶的活性，就能准确辨别蜂蜜的真假。

现有测定蜂蜜中淀粉酶活性方法的国家标准中用酶的底物是可溶性淀粉溶液，每次测定时所用的淀粉溶液都需当天配置，相对麻烦，且每次所用溶液的量不多，而配置的用不完的试剂经常倒掉造成了淀粉溶液的浪费，并污染环境。真空冷冻干燥后的物品一般情况下保存时间长，性质基本不变。鉴于此，本实验把可溶性淀粉溶液进行冷冻干燥保存，每次使用时只需要称取所需的量再加适量的蒸馏水溶解即可，不仅节约成本和时间，并可避免淀粉溶液的浪费。

天然蜂蜜中α-淀粉酶最适温度40℃左右，随温度的上升酶活下降很快。掺假蜂蜜中添加的中温α-淀粉酶耐高温特性较强，最适温度60℃。为此，本方法测定40℃及60℃的酶活性，如果60℃还有酶活性，说明蜂蜜样品中加入了工业淀粉酶，应为掺假蜂蜜。

一、材料与方法

（一）材料

试验原料有：槐花蜂蜜，山花蜂蜜，荆条蜂蜜。主要试剂（分析纯）有：碘、碘化钾、乙酸钠、冰乙酸、氯化钠、可溶性淀粉。

主要仪器有：unic7200可见分光光度计;电子万用炉;HH-6恒温水浴锅;PL303电子天平;pHS-3C精密pH;Quanta 200扫描电子显微镜;真空冷冻干燥仪FD-1D-50。

（二）试验方法

1、淀粉溶液的标定与配制。采用GB/T 18932.16-2003中淀粉溶液的标定方法;对蜂蜜样品采用GB/T18932.16-2003蜂蜜中淀粉酶值的测定方法配制溶液，测定α-淀粉酶。

2、冻干淀粉的制备。将所制淀粉溶液30mL，置于-80℃的冰箱中预冻，冻好后在真空冷冻干燥机中干燥49h。干燥条件：样品温度20℃，冷阱温度-60℃，真空度1Pa。测定其水分含量≤5%，符合试剂中的水分含量标准，所以对试验结果影响不大。取出后存放在冰箱中备用。制备冻干淀粉溶液时，称取冷冻干燥的淀粉0.1g于试管中，加入5mL蒸馏水，使其溶解完全。

3、淀粉颗粒电镜观察。将冻干淀粉与原可溶性淀粉样品置于扫描电子显微镜下观察，拍摄具有代表性的淀粉颗粒的形貌特征。

二、结果与分析

（一）淀粉溶液的标定与冷冻干燥

按照淀粉溶液的标定方法，在配制的淀粉溶液中逐渐加入不同量的水，用分光光度计在660 m波长下测定吸光度，确定稀释系数。结果见表1。

由表1可知，加水23mL时吸光度在0.760±0.02之间，所以在样品测定时稀释系数为23mL。

淀粉溶液冷冻干燥后肉眼观察的形貌如图1。由图1可以看出，淀粉冷冻干燥后体积膨胀变大，相互连在一起，不再呈现松散的颗粒状。

（二）淀粉冷冻干燥前后的电镜观察

由图2（b）可以看出，原可溶性淀粉呈现多角或不规则椭圆形，是分散开的一个个淀粉颗粒，大小不一，表面光滑，结构比较紧密，直径大约有50μm;图2（a）可以看出，真空冷冻干燥的糊化淀粉具有疏松膨胀的网状结构，有些呈片状结构，片状结构较薄，片形不规则，大小不一，互相叠在一起。这种疏松多孔的结构状态容易与水充分接触，可以加快淀粉的吸水速度，提高了溶解效率，且能更好被酶解，有利于试验的进行。

（三）淀粉冷冻干燥前后蜂蜜样品中淀粉酶值测定结果的比较

按照α-淀粉酶的测定方法，用冻干淀粉溶液与原淀粉溶液分别测定三种蜂蜜样品中α-淀粉酶的活性，见表2。

由表2可以看出，淀粉冷冻干燥前后测定的蜂蜜样品中α-淀粉酶的活性无显著差异，表明冷冻干燥的淀粉可以用于蜂蜜中α-淀粉酶的测定。

（四）真空冷冻干燥淀粉随温度变化的稳定性试验

把冻干淀粉分别置于0℃、10℃、20℃、30℃和40℃环境下保存一天，测定三种蜂蜜样品的淀粉酶活性值，结果见表4。

由表4可知，冷冻干燥过的淀粉在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃存放下三种蜂蜜中淀粉酶值的测定结果的相对标准偏差分别为1.9%、1.7%、3.7%。说明冷冻干燥过的淀粉在不同温度下性质比较稳定，比较容易保存。

（五）真空冷冻干燥淀粉随时间变化的稳定性试验

冷冻干燥过的淀粉放在冰箱中保存，分别在一周、二周、三周、四周时取出测定三种蜂蜜样品淀粉酶值，结果如表5。

由表5可知，淀粉经冷冻干燥之后稳定性较好，随时间的变化，三种蜂蜜样品淀粉酶值的测定结果的相对标准偏差分别为1.1%、2.0%、3.1%。基本上不影响蜂蜜α-淀粉酶的测定，可以长期保存、使用。

三、结论

把可溶性淀粉溶液用真空冷冻干燥法干燥后，性质稳定，随温度和时间的变化，对蜂蜜中α-淀粉酶值的测定结果无显著影响。对冻干淀粉进行镜检，发现淀粉的形貌发生了很大变化，糊化的淀粉吸水溶胀而相互交联成片状结构，更容易溶于水，且能更好地被酶作用，提高反应效率。本试验将淀粉冷冻干燥后，使用时直接定量称取，试验更加方便、快捷，简化了國标测定蜂蜜中α-淀粉酶值的方法。同时，试验结果的稳定性良好，可以满足对样品的检测，为进一步制作蜂蜜快速检测试剂盒提供依据。

（责任编辑 曹雯梅）