参草通脉颗粒对慢性心衰大鼠Wnt通路抑制因子表达的影响

刘晓蕾　张艳

【摘要】 目的 探讨参草通脉颗粒治疗慢性心力衰竭（CHF）的疗效机制。方法 80只SPF级SD雄性大鼠应用冠脉结扎法， 采用酶联免疫法（ELISA）方法， 随机选取10只为正常组， 造CHF大鼠模型后剩余59只大鼠随机分为模型组（19只）， 参草通络颗粒组（20只）， 赖诺普利组（20只）， 测定大鼠血清中Dickkopf-1（DKK1）、分泌型卷曲相关蛋白1（sFRP1）和Wnt抑制因子-1（WIF1）水平。

结果 模型组的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平分别为（3.48±0.82）、（191.56±3.78）、（55.16±0.94）μg/L均高于正常组的（1.59±0.08）、（86.84±4.02）、（22.58±0.95）μg/L、赖诺普利组的（2.87±0.27）、（169.75±2.89）、（46.41±2.12）μg/L及参草通脉颗粒组的（2.25±0.09）、（126.36±6.37）、（36.18±2.06）μg/L;且赖诺普利组的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平均高于参草通脉颗粒组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。

结论 参草通脉颗粒通过调控Wnt通路抑制剂， 可以有效发挥治疗CHF的作用。

【关键词】 慢性心力衰竭;参草通脉颗粒;分泌性卷曲相关蛋白-1;Wnt抑制因子-1;Dickkopf-1

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.28.093

CHF是多种心脏疾病的终末期表现。Wnt信号通路是近年来研究的热点， 在CHF发生和发展中发挥重要作用。研究发现Wnt信号通路抑制因子可阻断Wnt信号通路传导， 对心脏具有保护作用[1， 2]。参草通脉颗粒是临床应用30余年治疗CHF的经验方， 通过多年的临床观察和试验， 参草通脉颗粒对CHF患者疗效确切[3]。本实验通过检测Wnt传导通路抑制因子DKK1、sFRP1、WIF1， 探讨参草通脉颗粒治疗CHF的疗效机制， 现将结果报告如下。

1 材料与方法

1. 1 实验动物 选取15周龄， 80只SPF级SD雄性大鼠， 体重为250～300 g， 由辽宁中医药大学动物实验中心提供。

1. 2 药物制备 参草通脉颗粒（神威药业集团有限公司， 国药准字Z20055492）组成：丹参、人参、黄芪、红花、三七粉、益母草、茯苓、葶苈子处方中的全部药材均符合参照国家药典2010版有关规定。赖诺普利片（国药集团汕头金石制药有限公司， 国药准字H20065768）。

1. 3 实验试剂和仪器 DKK1、sFRP1、WIF1蛋白测定的ELISA试剂盒， 低温高速离心机， 酶标仪等。

1. 4 CHF大鼠动物模型制备 大鼠正常条件下适应喂养7 d后， 为全部动物编号后随机抽取10只为正常组。其余大鼠禁食不禁水12 h后， 腹腔麻醉， 气管插管， 设置呼吸机参数（潮气量：0.7 ml/kg， 频率：80次/min）， 消毒后在左侧第3、4肋间横向切开长约1～2 cm， 逐层分离， 暴露视野可见心脏， 用缝合线结扎距离左冠脉前降支起始点2～3 mm处， 心电图提示胸导ST段和T波出现明显异常， 说明结扎成功， 将心脏送回胸腔， 用注射用青霉素钠（哈药集团制药总厂， 国药准字H23021439）手术切口处敷用， 大鼠生命体征平稳后， 撤掉呼吸机。预防术后感染， 连续3 d应用注射青霉素钠30万IU， 1次/d。正常饲养1周后， 喂養饲料减少1/2;同时大鼠进行力竭式游泳1次/d， 连续4周。经超声检测左室射血分数（LVEF）≤60%， 可以判定为心力衰竭， 同时列入观察对象[4]。

1. 5 实验分组与给药 大鼠在造模前、后共死亡11只， 将剩余59只大鼠， 按照随机数字表法分成模型组（19只）、参草通脉颗粒组（20只）、赖诺普利组（20只）， 空白对照组为正常喂养未手术造模的大鼠。空白对照组和模型组大鼠不用药， 灌胃生理盐水10 ml/kg， 1次/d。其余组大鼠用药剂量， 按人鼠剂量换算公式， 剂量（g/kg）=药品剂量（人口服）（g）×0.018/动物体重（kg）[5]， 计算出赖诺普利组服用生药剂量为1.5 mg/（kg·d）， 参草通脉颗粒组服用生药剂量为9.2 g/（kg·d）， 两组药溶于3 ml蒸馏水1次/d灌胃， 各组连续给药42 d。

1. 6 实验取材 大鼠麻醉、处死， 腹主动脉取血， 离心， 收集上清液， 分装后低温保存， 用于检测DKK1、sFRP1、WIF1蛋白浓度。

1. 7 方法 采用ELISA法， 测定比较各组大鼠血清DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平。按照试剂盒说明及仪器要求的操作步骤进行。

1. 8 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组大鼠血清DKK1蛋白水平比较 模型组的DKK1蛋白水平高于正常组、赖诺普利组及参草通脉颗粒组;赖诺普利组的DKK1蛋白水平高于参草通脉颗粒组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 各组大鼠血清sFRP1蛋白水平比较 模型组的sFRP1蛋白水平高于正常组、赖诺普利组及参草通脉颗粒组;赖诺普利组的sFRP1蛋白水平高于参草通脉颗粒组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2. 3 各组大鼠血清WIF1蛋白水平比较 模型组的WIF1蛋白水平高于正常组、赖诺普利组及参草通脉颗粒组;赖诺普利组的WIF1蛋白水平高于参草通脉颗粒组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3 讨论

在CHF发病机制过程中Wnt信号通路是近年一直研究的热点， Wnt信号通路主要由Wnt蛋白、细胞膜受体、胞浆内信号转导部分和核内转录调控部分组成， 分为经典和非经典Wnt通路[6]。研究发现[7， 8]， CHF发生过程中， 在经典通路， Wnt蛋白与受体LRP5/6和FZD结合， 激活Wnt-β-catenin信号通路， 诱导心肌细胞肥大。非经典通路， Wnt蛋白与受体FZD结合， 激活Wnt/Ca2+和Wnt/PCP/JNK信号通路， 促进心肌肥厚的发生[9]。DKK1、sFRP1、WIF1是Wnt信号通路抑制剂， 通过不同途径影响Wnt配体-受体的结合， 调节Wnt信号通路转导[10]。DKK1可以抑制Wnt蛋白配体与受体LRP5/6结合， 阻断Wnt信号通路转导[11]。而sFRP1和WIF1先与Wnt蛋白结合， 阻止Wnt蛋白与FZD受体结合， 亦阻断Wnt信号通路传导[12]。因此DKK1、sFRP1、WIF1通过阻断Wnt信号通路传导， 可延迟CHF的发生和发展， 对心脏具有保护作用。

参草通脉颗粒是多年临床治疗CHF的经验方， 作者团队前期对280例CHF患者临床试验研究， 结果证明参草通脉颗粒可明显改善患者心功能分级， 提高LVEF水平[12]。该药物由黄芪、人参、红花、丹参、益母草、三七粉、葶苈子、茯苓组成。药理学研究表明[13]， 黄芪对心肌活性亦有保护作用， 它已用于CHF的治疗， 黄芪甲苷是正性肌力作用的主要活性成分， 对心力衰竭患者具有改善心肌舒缩功能、排钠利尿、抑制心肌重构、改善心肌能量代谢、抑制心肌细胞凋亡、抑制氧化应激、抑制纤维化等多种作用。人参治疗CHF过程中， 人参皂苷成分起主要作用， 研究表明[14]， 人参皂苷也可降低心力衰竭大鼠心肌胶原含量， 抑制心肌纤维化改善心室舒、缩功能。红花的有效成分红花黄色素， 具有兴奋心脏作用， 使心跳有力， 振幅加大， 增加冠状动脉血流量和降低冠状动脉阻力， 改善心肌缺血[15]。丹参有效成分为丹参酮Ⅱ， 通过影响心肌细胞Ca2+内流， 阻断信号转导， 抑制心室肥厚[16]。益母草中盐酸水苏碱成分能降低心脏指数、左心室指数和心肌细胞横截面积， 还能够抑制肥厚心肌组织心房肽（ANP）和脑钠素（BNP）的表达， 对心肌肥厚具有一定的抑制作用[17]。三七的有效成分是三七总皂苷， 三七总皂苷可以显著提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性， 改善离子转运， 抑制心肌间质细胞胶原增生， 抑制心肌肥厚[18]。葶苈子具有显著的利尿作用， 增加心脏输出量减轻心脏负荷， 同时葶苈子能抑制神经内分泌系统的过度激活， 防止心室重构[19]。茯苓素作为茯苓的主要活性成分， 是新的醛固酮受体拮抗剂， 体外可竞争醛固酮受体， 体内逆转醛固酮效应， 具有利尿消肿的作用[20]。

本实验结果显示， 模型组的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平高于正常组、赖诺普利组及参草通脉颗粒组;赖诺普利组的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平高于参草通脉颗粒组， 差异均具有统计学意义（P<0.01）。提示是机体应对心脏结构改变和CHF发生的一种负反馈现象。经药物干预后， 参草通脉颗粒效果较优。

综上所述， 参草通脉颗粒对Wnt信号通路抑制剂的表达水平有明显调控作用， 阐明了参草通脉颗粒治疗CHF作用机制， 为CHF患者的临床治疗提供了理论基础。

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[收稿日期：2020-05-06]