综合放血法所致血虚证小鼠模型的比较研究

胡柳 韩铨 吴妍 王威 李栋

[摘要]目的 通過比较不同造模参数的综合放血方法，确定血虚模型的最优造模参数，为该方法的可重复标准化提供数据支持。方法 将100只ICR小鼠随机分为5组：正常对照组（n=20）、模型组A（每日游泳15 min+隔日放血0.3 ml，n=20）、模型组B（每日游泳10 min+隔日放血0.3 ml，n=20），模型组C（每日游泳15 min+隔日放血0.5 ml，n=20）以及模型组D（每日游泳10 min+隔日放血0.5 ml，n=20），造模9 d后取胸腺、脾脏以及血液，测定5组小鼠的体重、免疫器官指数、死亡率、血常规指标、血清免疫因子白细胞介素-6（IL-6）水平及红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性。结果 模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后的体重、免疫器官指数、血常规指标（红细胞、白细胞、血红蛋白和血小板）、血清IL-6水平和红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性均低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;模型组B小鼠造模9 d后的死亡率低于模型组A、C和D，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 每日游泳10 min+隔日放血0.3 ml为较优的中医血虚证候模型的造模参数。

[关键词]综合放血法;血虚证;中医证候模型

[中图分类号] R332          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）9（b）-0035-04

Comparative study of mouse model of blood deficiency pattern caused by comprehensive bloodletting

HU Liu   HAN Quan   WU Yan   WANG Wei   LI Dong

Zhejiang Yangshengtang Natural Medicine Research Institute Co. Ltd.， Zhejiang Province， Hangzhou   310024， China

[Abstract] Objective To compare the comprehensive bloodletting in different modeling parameters to determine the optimal one with blood deficiency pattern， and to provide data support for the repeatable standardization of the method. Methods A total of 100 ICR mice were randomly divided into 5 groups： normal control group （n=20）， model group A （15 min swimming daily+bloodletting 0.3 ml every other day， n=20）， model group B （10 min swimming daily+bloodletting 0.3 ml every other day， n=20）， model group C （15 min swimming daily+bloodletting 0.5 ml every other day， n=20） and model group D （10 min swimming daily+bloodletting 0.5 ml every other day， n=20）. Thymus， spleen and blood were collected for measuring the weight， immune organ index， blood routine indicators （including red blood cells， leukocytes， hemoglobin and platelets）， serum interleukin-6 （IL-6） levels and erythrocyte membrane Na+-K+-ATPase activity after nine days model establishment. Results The weight， immune organ index， blood routine indicators （including red blood cells， leukocytes， hemoglobin and platelets）， serum IL-6 levels and erythrocyte membrane Na+-K+-ATPase activity in the model group A， B， C， and D were lower than those in the normal control group after nine days model establishment， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The animal mortality rate of the model group B was lower than that of model group A， C， and D， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Daily swimming for 10 min + bloodletting 0.3 ml every other day is the optimal model parameters for traditional Chinese medicine syndrome of blood deficiency pattern.

[Key words] Comprehensive bloodletting; Blood deficiency pattern; Traditional Chinese medicine syndrome model

血虚证是临床常见的病症，多数原因为失血过多、脾胃虚弱，或者血液生化之源不足以及瘀血阻滞等。目前国内研究人员造模采用较多的是慢性放血，使其“有形之血不能速生”，配合疲劳、饥饿等方式损伤其中焦脾胃，造成脾虚、气虚，使血液生化之源匮乏而制作出接近临床血虚证表现的小鼠动物模型，充分弥补了早期通过放化疗损伤这个单一因素造模不能全面反映中医血虚证候复杂的病理变化的缺陷。但该中医证候动物模型没有统一标准的造模参数，造成研究者重复实验时需要重新摸索参数，浪费大量时间和精力。本研究通过对比力竭运动时间（游泳时间）及放血体积的不同参数对小鼠体重、免疫器官指数、死亡率、血常规指标、血清白细胞介素-6（IL-6）水平及红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性的影响，确定血虚证的最优造模参数，现报道如下。

1实验材料与方法

1.1实验动物及分组

实验用ICR小鼠[上海斯莱克实验动物有限责任公司;生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005]100只，雄性，6周龄，体重（25±1）g，于浙江省医学科学院动物实验中心饲养，室内温度（22±2）℃，相对湿度30%～40%，各组小鼠喂食常规饲料，自由饮水。ICR小鼠经适应性饲养1周后，随机分为正常对照组与4个不同参数模型组（模型组A、B、C、D），每组各20只。实验在浙江省医学科学院动物医学伦理委员会批准下进行。

1.2试剂及仪器

ATP酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）;IL-6 Elisa试剂盒（美国R&D公司）;库尔特细胞全自动分析仪（美国Becman公司）。

1.3造模方法

小鼠适应性饲养后，每日模型组4组小鼠置于自制塑料盒（50 cm×120 cm×40 cm）中强迫游泳10 min或15 min，水温20℃，隔日眼眦取血0.3 ml或0.5 ml，实验期间饲料控制在每日75 g/kg，连续9 d，制成血虚证模型。其中模型组A（n=20）：15 min游泳+0.3 ml放血;模型组B（n=20）：10 min游泳+0.3 ml放血;模型组C（n=20）：15 min游泳+0.5 ml放血;模型组D（n=20）：10 min游泳+0.5 ml放血。

1.4取材及检测

于造模后第10天，对各组小鼠进行股动脉取血，除了抗凝全血外，1500 r/min离心10 min，取得血清做生化测定，处死动物后取胸腺和脾脏称重。

取抗凝全血加入血细胞分析仪中上机直接进行血常规分析，主要测定红细胞、白细胞、血小板以及血红蛋白数量。

将肝素钠抗凝全血4℃离心（1500 r/min，10 min），吸去上清液并小心吸去压积红细胞上层的白色绒毛状膜成分。将压积红细胞用10倍体积的4℃生理盐水悬浮，4℃离心（1500 r/min，10 min），重复2～3次。直到上清液无色，吸去上清液，保留压积红细胞。取压积红细胞按1∶10比例加入去离子水，混匀混合。4℃放置20 min，由于出现溶血现象，液体由鲜红色变为透明暗红色。4℃平衡离心（12 000 r/min，30 min），吸去暗红上清液，可见底部一块粉红色沉淀，重复3次，直到沉淀部分呈乳白色，弃去上清液及离心管底部褐色的纤维蛋白样沉淀斑，收集白色或浅粉色血影膜。将血影膜悬浮于一定体积的去离子水中，混合均匀，用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。规定每小时每107个红细胞的Na+-K+-ATP酶分解三磷酸腺苷（ATP）产生1 μmol无机磷的量为一个Na+-K+-ATP酶活性单位，即μmol Pi/（107个红细胞·h）。按ATP酶试剂盒说明书测定红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性。

1.5统计学方法

采用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析，符合正态分布计量资料的均数用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，不符合正态分布者经过变量转换为正态分布后行统计学分析;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义，以P<0.01为统计学差异极显著。

2结果

2.1各组小鼠的一般状况

外观变化可以清楚地反映小鼠的进食、饮水、饲养等情况。在实验造模期间内，模型组A、B、C、D的小鼠外观均发生了比较明显的变化，如耳廓鼻唇颜色变浅、皮毛不光泽、精神萎靡、腰背团缩、动作灵敏度降低等。

2.2各组小鼠体重、免疫器官指数和死亡率的比较

模型组A、B、C、D小鼠的初始体重与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后的体重均低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后的体重比较，差异无统计学意义（P>0.05）。模型组A、B、C、D小鼠的免疫器官指数（胸腺指数和脾脏指数）均低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后的胸腺指数和脾脏指数比较，差异无统计学意义（P>0.05）。模型组A、C和D小鼠造模9 d后死亡率高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组B小鼠造模9 d后死亡率与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。模型组B小鼠造模9 d后死亡率低于模型组A、C和D，差异有统计学意義（P<0.05）（表1）。

2.3各组小鼠血常规指标的比较

模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后的红细胞、白细胞、血红蛋白以及血小板计数均低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后的血常规指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

2.4各组小鼠血清IL-6水平和红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性的比较

模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后的血清IL-6水平和红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性均低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后的血清IL-6水平和红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。

3讨论

中医认为肝藏血，具有贮藏血液、调节血量及防止出血的功能;脾统血，具有统摄、控制血液在脉中平稳运行，防止血液溢出脉外的功能，如《金匮要略》所述“五脏六肺之血，全赖脾气统摄。”失血会引起肝脏萎缩，藏血功能失常;脾脏萎缩，统摄血液功能失常;胸腺萎缩，免疫功能低下，从而表现为血虚的证候。血虚证动物模型研究目前有失血性（综合失血法）、化学损伤[1-2]、放射性损伤[3-4]和免疫介导[5-6]4类模型。通过中医学的定义和古籍文献的描述可知，血虚多由失血、劳倦、饮食不足等原因引起，故本研究采用综合放血法（力竭游泳+放血+限食），符合血虚证中医证候的病因。经过每日观察记录发现模型组小鼠在造模后的第3天即出现行动迟缓，团缩弓背，面、眼、耳、尾苍白而凉，毛蓬竖而少光泽，血色暗红，大便稀等典型血虚症状。

通过整理文献报道的综合放血法致血虚模型，发现造模参数差异较大，有每日强迫力竭游泳20 min+隔日放血0.3 ml[7]、也有隔日游泳20 min+隔日放血0.4 ml[8-10]、隔日游泳20 min+隔日放血0.3 ml以及每日游泳2次（时长不定）+隔日放血0.5 ml等，对新的研究者的参考意义并不大。本研究通过设置不同的力竭游泳时间和放血量，考察体重、免疫器官指数、死亡率、血常规指标、血清IL-6水平及红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性对比血虚模型的造模程度，结果显示，模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后的体重及免疫器官指数均低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。红细胞为运送氧气的主要媒介且具有免疫功能，血红蛋白含量高低代表着血虚程度的轻重，白细胞为免疫细胞，具有吞噬异物产生抗体的作用，而血小板在造血过程中也发挥重要作用。本研究结果显示，模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后的红细胞、白细胞、血红蛋白以及血小板含量均低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），说明血虚小鼠的红细胞运输功能受到损伤，机体免疫水平低下，与其他研究者的结论较为一致[11-13]，并且随着造模参数的变化，造模严重程度也加重。免疫细胞因子IL-6可诱导活化后的B细胞对免疫球蛋白（Ig）的分泌，同时促进T细胞的活化增殖、分化，尚能与IL-3协同诱导多种造血前体细胞的增殖，而兴奋体液免疫系统，同时对细胞免疫和造血功能也有促进作用。本研究结果显示，模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后的血清IL-6水平低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），与免疫器官指数、白细胞水平降低均一致，说明血虚证小鼠具有免疫力低下的状况[14]，与其他研究者的结论一致[5]。红细胞膜结构和功能的完整是红细胞发挥作用的重要保证，而红细胞的功能主要是通过膜蛋白来实现的，细胞膜上的Na+-K+-ATP酶保持膜内高钾，膜外高钠的平衡，能将ATP分解为二磷酸腺苷（ADP）并产生能量，对维持红细胞的形态和功能具有重要作用，但在血虚状态下其活力明显降低。本研究结果显示，模型组A、B、C、D小鼠造模9 d后Na+-K+-ATP酶活性低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），与其他研究者的结论一致[15-20]。4种造模参数下都能够成功制作出血虚模型，且4个模型的评估指标无显著差异。本研究结果显示，模型组A、C和D小鼠造模9 d后的死亡率高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），提示造模过严重会导致模型小鼠死亡率的大幅度增加。小鼠的死亡原因均为当晚被同笼相对较强的小鼠咬死并食用，因此模型组A、C和D无法达到每日限食75 g/kg的精确实验条件，为实现造模方法的标准化且具有可重复性，在4组模型都造模成功的基础上，优先考虑模型组B的造模参数，即每日强迫力竭游泳10 min+隔日放血0.3 ml。

目前对于中医证候模型血虚证判定成模的标准基本都以现代医学的客观指标为基础，并根据阳性结果来判定，但对于这些客观指标的特异性和权重并没有深入研究，只有确定权重系数和量化指标的重要性，才能使得中医证候模型更切合临床实际情况和更具有可重复性，可在下一步研究中深入探讨。

[参考文献]

[1]亢泽峰，庄曾渊，万素君，等.益气养血活血中药对实验性血虚证大鼠视网膜病理改变的影响[J].中国中医眼科杂志，2000，10（4）：199-202.

[2]李偉，彭欣，王冰，等.四物汤调节血虚大鼠微循环机制的实验研究[J].陕西中医，2009，30（12）：1662-1663.

[3]郭平，梁乾德，胡剑江，等.四物汤对放射线致血虚证小鼠骨髓Epo和G-CSF基因表达的影响[J].中国中药杂志，2005，30（15）：1173-1176.

[4]郭平，王继峰，王升启.芍药苷对放射线致血虚证小鼠骨髓Epo和G-CSF基因表达的影响[J].山东中医药大学学报，2005，29（3）：236-239.

[5]朱映黎，王林元，赵丹萍，等.芍药内酯苷、芍药苷对血虚免疫抑制小鼠的补血作用及机制[J].北京中医药大学学报，2016，39（3）：204-207.

[6]王穆，让蔚清，张琪，等.四物汤对环磷酰胺所致血虚证治疗后的代谢组学研究[J].中国中药杂志，2010，35（5）：630-634.

[7]张建军，黄银峰，王丽丽，等.白芍、赤芍及芍药苷、芍药内酯苷对综合放血法致血虚小鼠补血作用的比较研究[J].中国中药杂志，2013，38（19）：3358-3362.

[8]谭玮，宋崇顺，谭洪玲，等.四物汤对综合放血法致小鼠血虚证造血功能的影响[J].中国中药杂志，2005，30（12）：926.

[9]霍超，马增春，王穆，等.综合放血法所致血虚证小鼠模型及四物汤反证的代谢组学研究[J].中国中药杂志，2010， 35（23）：3194-3198.

[10]谭洪玲，马增春，肖成荣，等.四物汤对3种血虚证动物细胞周期的影响[J].解放军药学学报，2010，26（2）：158-161.

[11]袁拯忠，叶人，陈增强，等.两种血虚证小鼠模型的比较[J].中华中医药学刊，2009，27（6）：1265-1266.

[12]林新艳，殷书梅，王宓，等.黄芪精对血虚症、气虚症模型小鼠的药效学研究[J].中国药业，2012，21（6）：19-20.

[13]周建辉，阮耀，李克卉，等.巴戟天水提液对血虚型小鼠造血功能的影响[J].国医论坛，2012，27（6）：47-48.

[14]苗明三，王智明，孙艳红.怀熟地黄多糖对血虚大鼠血像及细胞因子水平的影响[J].中药药理与临床，2007，23（1）：39-40.

[15]杨岚，陈为.四物汤对血虚小鼠红细胞膜Na+-K+-ATP酶的影响[J].海南医学院学报，2003，9（1）：10-12.

[16]曾繁强，徐永莉，江思华，等.红毛鸡干燥体醇提物对血虚模型小鼠的补血作用研究[J].中国药房，2016，27（31）：4373-4375.

[17]伍文彬，张廷模，王飞.赤白芍对血虚证动物模型补血作用及机制研究[J].中药药理与临床，2012，28（3）：69-71.[18]张明.甘肃不同产地当归质量及补血活血作用的比较研究[D].兰州：甘肃中医药大学，2015.

[19]苗明三，佟丽，方晓艳，等.大鼠气血双虚动物模型的建立[C].中国实验动物学会.中国实验动物学会第六届学术年会论文集，2004：79-87.

[20]苗明三，苗艳艳，孙艳红.大枣多糖对血虚大鼠全血细胞及红细胞ATP酶活力的影响[J].中国临床康复，2006，10（11）：97-99.

（收稿日期：2019-07-25）