MTHFR C677T基因多态性与同型半胱氨酸及冠心病的关系

赵唱 贺欣

[摘要]目的 探討亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T位点基因多态性与血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平及冠心病（CHD）的关系。方法 选取2016年12月～2019年10月阜新市第五人民医院和锦州医科大学附属第一医院收治的153例CHD患者作为CHD组，同期149例健康体检者作为对照组。收集血脂、Hcy等生化指标的临床资料，应用酶循环法测定血浆Hcy水平，并留取血液样本，提取基因组DNA，应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测MTHFR基因C677T位点基因多态性。结果 在CHD组不同基因型中，Hcy水平在CC基因型中最低，在TT基因型中最高（P<0.05）;在对照组中，不同基因型的Hcy水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。CHD组的CC基因型、C等位基因频率占比低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;CHD组的TT基因、T等位基因频率所占比例高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。TT基因型为患CHD的独立危险因素（OR=4.388，95%CI：2.091～5.695，P=0.001），CC基因型为CHD的独立保护因素（OR=0.590，95%CI：0.393～0.921，P=0.001）。结论 MTHFR C677T基因多态性中TT基因型是CHD的发病危险因素。血浆Hcy水平与其密切相关，血浆Hcy水平升高与TT基因型突变和T等位基因有关。血浆Hcy水平及MTHFR C677T多态性可以作为研究CHD病因、发病机制及其遗传机制的重要参考指标。

[关键词]同型半胱氨酸;亚甲基四氢叶酸还原酶;冠心病;基因多态性

[中图分类号] R541.4          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）9（b）-0004-04

Relationship between MTHFR C677T gene polymorphism and homocysteine and coronary heart disease

ZHAO Chang1   HE Xin2

1. The Third Department of Cardiology， Fuxin Central Hospital， Liaoning Province， Fuxin   123000， China; 2. The Third Department of Cardiology， the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University， Liaoning Province， Jinzhou   121000， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between C677T polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase （MTHFR） and the level of plasma homocysteine （Hcy） as well as coronary heart disease （CHD）. Methods From December 2016 to October 2019， 153 patients with CHD from Fuxin Fifth People′s Hospital and the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University were selected as CHD group， and 149 subjects for healthy examination were selected as the control group at the same period. The clinical data of biochemical indexes such as blood lipid and Hcy were collected. The plasma Hcy level was measured by enzyme circulation method. The blood samples were taken to extract genomic DNA， and the C677T polymorphism of MTHFR gene was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP）. Results The Hcy level was the lowest in CC genotype and the highest in TT genotype in CHD group （P<0.05）. In the control group， the Hcy level in different genotypes showed no significant difference （P>0.05）. The proportions of CC genotype and C allele frequency in the CHD group were lower than those in the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The proportions of TT genotype and T allele frequency in the CHD group were higher than those in the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. TT genotype was an independent risk factor for CHD （OR=4.388， 95%CI： 2.091-5.695， P=0.001）， and CC genotype was an independent protective factor for CHD （OR=0.590， 95%CI： 0.393-0.921， P=0.001）. Conclusion TT genotype in MTHFR C677T polymorphism is a risk factor for CHD. The plasma Hcy level is closely related to it， the increase of plasma Hcy level is related to TT genotype mutation and T allele. Hcy level in plasma and MTHFR C677T polymorphism may be an important reference indexes to study the etiology， pathogenesis and genetic mechanism of CHD.

[Key words] Homocysteine; Methylenetetrahydrofolate reductase; Coronary heart disease; Gene polymorphism

最近研究表明，同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）处于高水平是导致冠状动脉病变的独立危险因素[1-2]。作为Hcy代谢的关键酶亚甲基四氢叶酸还原酶（methy-lenetrahy drofolate reductase，MTHFR）基因常在677位发生错义突变，导致该酶的活性下降，引起Hcy水平上升。有研究发现，该基因是心血管疾病发生的危险因素[3-4]。本研究选取冠心病（coronary heart disease，CHD）患者作为研究对象，通过分析MTHFR C677T基因多态性和等位基因频率，进一步探索MTHFR C677T基因多态性和血浆Hcy水平的相关性以及MTHFR C677T基因多态性与CHD发病的相关性，从遗传角度为CHD的发病机制及诊疗提供新的方法，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年12月～2019年10月于阜新市第五人民医院和锦州医科大学附属第一医院住院和门诊就诊的经冠状动脉造影确诊的153例CHD患者作为CHD组，同时收集149例健康体检者作为对照组。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有试验均符合伦理准则，并获得研究对象或亲属的知情同意。CHD诊断标准：中华医学会急性非ST段抬高型急性冠脉综合征诊断和治疗指南及急性ST段抬高型心肌梗死诊断与治疗指南中颁布的急性冠脉综合征诊断标准[5-6]。

1.2方法

1.2.1实验室检测方法  采集空腹12 h以上外周静脉血至于EDTA抗凝，血浆-80℃冻存待测Hcy，血细胞作提取DNA用。Hcy通过酶循环法测定（上海科华卓越生化分析仪），检测试剂批号：14030403（北京中生公司）。通过全自动生化仪（BeckmanDXC800）测定血脂、肾功能、血糖指标。

1.2.2 DNA检测方法  采用人外周血DNA提取试剂盒（德国QIAGEN公司，批号：52904），提取人基因组DNA，采用Nano Drop检测基因组DNA浓度。基因组DNA置于-80℃贮存。应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测MTHFR基因单核苷酸多态性（C-T）。PCR引物為：上游5′-AGGCCCTATGGTAGTGCCTTT-3′，下游5′-TCTCTTAGTGCTGTG GTCAC-3′。PCR体系为：基因组DNA模板100 ng，上下游引物各2 μl，2×PCR MIX 25 μl，用ddH2O补足至50 μl。PCR反应温度设置如下：94℃变性8 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，34个循环，72℃延伸8 min，PCR产物4℃贮存。

1.3统计学方法

所有统计学资料由Epi data软件整理录入，采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用LSD-t检验;计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验。基因型频率的分布采用Hardy-Weinberg平衡χ2检验;应用Logistic回归分析CHD患病的危险因素，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 MTHFR基因酶切结果

MTHFR基因型酶切后电泳结果显示三种结果：CC基因型、CT基因型、TT基因型。PCR目的片段为246 bp，利用HinfI内切酶对246 bp的目的片段进行酶切，含C等位基因为246 bp，T等位基因被HinfI酶切成两条片段，分别为174 bp和72 bp。MTHFRC677T基因多态性符合Hardy-Wenberg平衡，具有群体代表性。

2.2两组MTHFR基因C677T基因型的比较

CHD组的CC基因型、C等位基因频率占比低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;CHD组的CT基因型占比与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;CHD组的TT基因、T等位基因频率所占比例高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.3两组受试者不同基因型临床资料的比较

对照组和CHD组不同基因型研究对象的年龄、糖尿病、高血压、吸烟和生化指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）。在CHD组不同基因型中，Hcy水平在CC基因型中最低，在TT基因型中最高（P<0.01）。在对照组中，不同基因型的Hcy水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

2.4不同基因型患CHD的Logistic回归分析

不同MTHFR基因C677T基因型患CHD的Logistic回归分析显示，TT基因型为患CHD的独立危险因素（OR=4.388，95%CI：2.091～5.695，P<0.01），而CC基因型为CHD的独立保护因素（OR=0.590，95%CI：0.393～0.921，P<0.01）（表3）。

3讨论

在Hcy的代谢途径中，5，10-亚甲基四氢叶酸还原到5-甲基四氢叶酸的反应中，黄素依赖酶MTHFR作为关键酶之一参与到上述还原反应中。MTHFR C677T点突变，使MTHFR氨基酸结构发生改变，进而影响MTHFR的活性[7]。Hcy通过促进低密度脂蛋白氧化，加速激活血小板聚集，使血管内皮受损，进而引起一系列心血管事件的发生[8]。Hcy水平受MTHFR活性的影响，当C677T发生突变时可引起MTHFR活性改变。国外研究认为，未发生MTHFR基因突变的患者其血浆Hcy水平明显低于发生突变的患者，等位基因的分布频率也与高水平的Hcy具有显著相关性[9-10]。本研究结果显示，MTHFR基因型有三种：CC基因型、CT基因型、TT基因型;MTHFR C677T基因多态性符合Hardy-Wenberg平衡，具有群体代表性;CHD组的TT基因、T等位基因频率所占比例高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。CHD组中，Hcy水平在CC基因型中最低，在TT基因型中最高（P<0.01），TT基因型Hcy水平高于CC基因型和TC基因型（P<0.05）。在对照组中，Hcy水平在各个不同基因型中未见明显差异（P>0.05）。因为Hcy代谢受MTHFR活性的影响，当TT基因型发生突变时会使MTHFR活性下降导致Hcy水平升高。高Hcy血症一个重要的遗传因素是MTHFR基因纯合突变。MTHFR的三种基因型中，对酶活性影响最大的为TT基因型。通过对37℃时CC与TT基因型发生突变时的酶活性比较，当TT基因型发生突变时，其酶活性降低明显，仅为CC型的50%左右[11]。CT基因型发生突变时酶活性也同样降低，其酶活性的下降程度居中。本研究可得出与上述一致的结论。由于Hcy特殊的临床意义，故可在有条件的情况下通过检测患者MTHFR C677T基因多态性来实现疾病的早期预防、治疗，同时在指导个体化用药方面同样具有重要意义。

血漿Hcy水平受基因及环境因素共同影响。由于MTHFR基因发生突变，使MTHFR酶活性降低，与叶酸结合能力下降[12-13]，同时，叶酸、维生素B12缺乏也可使Hcy升高[14]。通过对MTHFR遗传学的深入研究，人们发现该基因存在多种突变类型，常见的包括MTHFR G1793A、MTHFR T1317C、MTHFR C677T、MTHFR A1298C等[15]，在蛋白质表达过程中TT型形成了酶的不耐热表型，热稳定型为TC型。目前关于MTHFR基因多态性的研究众多，且结论众说纷纭，由于基因具有种族和民族的差异，所以会造成具有差异性的研究结果。荷兰的Almawi等[16]对Hcy水平与MTHFR C677T基因多态性相关性进行分析，结果表明，Hcy水平升高及T等位基因增加同样增加CHD的患病率。Sarecka-Hujar等[17]研究发现，在波兰人群中拥有TT基因型并且吸烟者患早发CHD的风险明显高于CC基因型且不吸烟者（OR=24.62），认为TT基因型是波兰人群早发CHD的重要危险因素。于善花等[18]发现CHD的发生与MTHFR C677T位点错义突变相关联。Li等[19]的研究中，MTHFR C677T TT基因型的急性冠状动脉综合征（ACS）患者比其他两个基因型有更严重的冠状动脉病变。本研究结果显示，CHD组中TT基因型个体血浆Hcy水平高于其他两基因型个体，差异有统计学意义（P<0.05）;对照组中TC杂合型与CC纯合型Hcy水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。因此，Hcy水平受MTHFR基因型影响，当MTHFR发生突变时影响CHD的患病率。TT基因型为患CHD的独立危险因素，CC基因型为CHD的独立保护因素（P<0.05）。因此，在心血管疾病的遗传分析研究中，可将MTHFR基因的遗传变异广泛使用[20]。

综上所述，CHD比较复杂，可能与基因型、环境因素、种族[21]等有关。Hcy升高及其代谢酶（MTHFR）C677T基因多态性可能与发生CHD有关，TT基因型可能为该人群易感基因型。然而，由于本研究样本例数偏少，结果难免存在一定偏差，有待更大规模的研究揭示该基因与CHD的关系。

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（收稿日期：2020-02-24）